[发明专利]用于使多能干细胞分化为血管床细胞的方法

权利要求书

1.用于使多能干细胞分化为血管床细胞的方法，所述方法包括步骤：

a)提供多能培养基中的单层多能干细胞；

b)在补充了小分子的激发培养基中孵育所述细胞，该小分子激活β-联蛋白和/或Wnt信号发放和/或Hedgehog(HH)信号发放，选自糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂、CDC样激酶1(Clk1-2-4)的小分子抑制剂、促分裂原活化蛋白激酶15(Mapk15)的小分子抑制剂、双特异性酪氨酸(Y)磷酸化调节激酶(Dyrk1a-b4)的小分子抑制剂、细胞细胞周期蛋白依赖激酶16(Pctk1-3 4)的小分子抑制剂、Smoothened(SMO)激活物，及β-联蛋白(或γ-联蛋白)与辅激活蛋白CBP(CREB结合蛋白)和p300(EIA结合蛋白p300)间相互作用的调节物；

c)通过在诱导培养基中孵育所述激发的细胞来诱导分化。

2.权利要求1的方法，用于使多能干细胞分化为内皮细胞。

3.权利要求1的方法，用于使多能干细胞分化为血管平滑肌细胞。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤a)还包括在多能培养基中孵育所述细胞18小时至30小时。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中步骤b)还包括在激发培养基中孵育所述细胞2至4天。

6.权利要求1至5中任一项的方法，其中步骤c)还包括在诱导培养基中孵育所述细胞18小时至48小时。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中步骤a)的所述多能培养基是补充了Rho相关卷曲螺旋形成蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶家族的蛋白激酶的抑制剂(ROCK激酶抑制剂)的无血清培养基。

8.权利要求7的方法，其中所述ROCK激酶抑制剂选自1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺和(+)-(R)-反-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中步骤b)的所述激发培养基是补充了胰岛素、运铁蛋白和孕酮的无血清培养基。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中步骤b)的所述激活β-联蛋白和/或Wnt信号发放和/或Hedgehog(HH)信号发放的小分子是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中步骤b)的所述激发培养基还包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。

12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述诱导培养基是补充了VEGF-A(血管内皮生长因子)或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活物的无血清培养基。

13.权利要求12的方法，其中所述小分子腺苷酸激活物选自Forskolin((3R)-(6aαH)十二氢-6β，10α，10bα-三羟基-3β，4aβ，7，7，10aβ-五甲基-1-氧-3-乙烯基-1H-萘并[2，1-b]吡喃-5β-基乙酸盐)、8-溴-cAMP(8-溴腺苷-3′，5′-环单磷酸盐)和肾上腺髓质素。

14.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述诱导培养基是补充了TGFβ信号发放和PDGF信号发放的激活物的血清替代品培养基或无血清培养基。

15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述多能干细胞是诱导型多能干细胞。

16.权利要求15的方法，其中所述诱导型多能干细胞是人细胞。

17.权利要求15或16的方法，其中所述诱导型多能干细胞获自患有与血管并发症相关的疾病的个体。

18.权利要求1至17中任一项的方法，其还包括步骤：

d)在适合用于增殖内皮细胞或血管平滑肌细胞的条件下孵育步骤c)的产物。

19.内皮细胞或血管平滑肌细胞，其通过权利要求1至18中任一项的方法获得。

20.内皮细胞或血管平滑肌细胞的生物样本库，其通过权利要求1至18中任一项的方法获得。