[发明专利]核酸酶融合蛋白及其用途

说明书

本发明涉及核酸酶融合蛋白及其多种用途。具体而言，涉及编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含(i)第一模块，所述第一模块至少包含源自归巢内切核酸酶的第一DNA结合结构域，(ii)接头，和(iii)第二模块，所述第二模块至少包含源自限制性内切核酸酶的第二DNA结合结构域和切割结构域，其中所述多肽仅与包含第一DNA结合结构域的DNA识别位点和第二DNA结合结构域的DNA识别位点的DNA在功能上相互作用，且其中在多肽结合后，所述切割结构域在特异性DNA切割位点内切割DNA。本发明还考虑了包含所述多核苷酸的载体以及非人转基因生物，和由本发明的多核苷酸编码的多肽。最后，本发明涉及用于将目标核酸导入非人生物的基因组中的方法，其中应用本发明的多肽。

限制性内切核酸酶是DNA分子克隆的重要工具。这些酶是在特异性的识别和切割位点切割DNA必需的，从而允许可重复地生成确定的DNA片段。此外，可以组合由限制性内切核酸酶生成的所述确定的片段与其他DNA分子，特别是出于分子克隆的目的在连接反应中与载体组合。限制性内切核酸酶可如何用于分子克隆的原则是多年已知的。

过去已经表征了许多不同的原核生物中的许多限制性内切核酸酶。需要极少切割基因组DNA的限制性内切核酸酶，即，基因组中仅存在于有限数量的所述限制性内切核酸酶的DNA识别和切割位点。本领域已知存在极少切割的、天然存在的内切核酸酶。然而，在统计学上，绝大多数所述限制性内切核酸酶在基因组中切割超过1次。最近，生成了统计学上更少切割基因组，有时甚至只切割1次的人工酶。

现有技术中已经报道了这样的人工融合蛋白，所述融合蛋白包含用于DNA结合的锌指结构域和限制性内切核酸酶FokI的非特异性DNA切割结构域(Wah1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：10564-10569；WO2003/080809；WO2007/139898；WO2002/057294；WO2000/27878；WO1999/45132；WO2003/062455；WO2002/057293)。报道了转录激活子样效应子(TALE)而不是锌指结构域作为与Fokd的非特异性DNA切割结构域融合时的非常高特异性的核酸酶的合适的基础(Christian2010，Genetics186(2)：757-U476)。

用于生成人工的、切点罕见大范围核酸酶(meganuclease)的其他方法基于归巢内切核酸酶，如LAGLIDADG归巢内切核酸酶，特别是I-CreI或I-SceI的(WO2009/076292；WO2007/047859；WO2008/152524；WO2008/102198；WO2008/093249；WO2007/034262；WO2003/078619；Doyon2006，J Am Chem Soc128：2477-2484)。还已经报道了包含归巢内切核酸酶(如I-SceI)和FokI的非特异性DNA切割结构域的人工融合蛋白(Lippow2009，核酸Res37(9)：3061-3073)。

此外，已经报道了在体内促进同源重组和DNA片段其他整合进入基因组的切点罕见内切核酸酶(WO2003/080809；WO2000/46386；WO2009/006297；WO2006/074956；WO2006/134496；WO2007/148964；WO2009/130695)。相应的，可以使用这些酶生成多种类型的转基因生物。

因此，需要其他的切点罕见内切核酸酶，特别是在确定的DNA切割位点进行切割并生产可以被生物的内源性DNA修复系统识别和使用的合适的切割产物使得促进目标DNA整合到所述生物的基因组中的那些切点罕见内切核酸酶。

因此，本发明潜在的技术问题可被视为提供符合上述需求的工具和方法。通过权利要求和下文表征的实施方案解决了上述技术问题。

因此，本发明涉及编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：

(i)第一模块，所述第一模块至少包含源自归巢内切核酸酶的第一DNA结合结构域；

(ii)接头；和

(iii)第二模块，所述第而模块至少包含源自限制性内切核酸酶的第二DNA结合结构域和切割结构域；

其中所述多肽仅与包含第一DNA结合结构域的DNA识别位点和第二DNA结合结构域的DNA识别位点的DNA在功能上相互作用，且

其中在多肽结合后，所述切割结构域在特异性DNA切割位点内切割DNA。