[发明专利]具有增加的脂肪酶活性的两亲性肽-脂肪酶缀合物及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及具有增加的脂肪酶活性的两亲性肽-脂肪酶缀合物，编码所述缀合物的多核苷酸，包含所述多核苷酸的表达载体，其中锚定了所述表达载体的转化体，构建所述缀合物的方法，使用所述缀合物的脂解方法，和使用所述脂肪酶制备生物柴油的方法。

背景技术

脂肪酶(三酰基甘油酰基水解酶，EC3.1.1.3)是催化甘油三酯水解为脂肪酸和甘油酯或甘油并且作为消化食物的三种消化酶之一与淀粉酶和蛋白酶一起具有重要作用的酶。脂肪酶天然地来源于广泛范围的生物体，包括动物、植物和微生物。

除了在体内脂类(lipid)代谢中具有重要作用，脂肪酶还可用于提高奶酪的风味，在蔬菜发酵时增加游离脂肪酸，在肉发酵时使风味变浓，以及脂解鱼肉。此外，脂肪酶的利用目前已经扩展到合成昂贵的、光学纯的异构体。而且，脂肪酶还应用于多种工业中。作为其一些实例，脂肪酶在乳品工业中的应用包括经由乳脂(milk fats)的水解和牛脂(butterfat)或奶油(crease)的裂解制备奶酪。在洗涤剂工业中，脂肪酶可以用来制备洗衣剂或洗衣机洗涤剂。该酶可以减小洗涤剂产品的环境载荷，因为它们通过使得待使用的洗涤温度更低而节约能量。脂肪酶在油脂化工中的应用范围是巨大的，包括制造不饱和脂肪酸和肥皂以及从廉价的棕榈油生产可可脂。在造纸工业中，脂肪酶被用来从木材中移除树脂或松香和从废纸中移除墨。转到制药工业，脂肪酶的利用包括合成单独的R-和S-光学异构体，分离外消旋体和制造药物。化妆品工业应用脂肪酶来生产皮肤化妆品，包括蜡、防晒霜和沐浴产品。此外，脂肪酶可在能源工业中用作从植物油中生产生物柴油的手段。

目前，生物柴油，作为新的可再生能源出现，在全世界已经使用基于化学催化剂的方法而进行生产。然而，因为大量有机溶剂的使用，环境处置的高昂费用，以及归因于高反应温度引起的高能耗，它们的商业化还没有成功。出于这些原因，采用脂肪酶作为催化剂的工艺得到了广泛的关注。这些工艺所享有的优点是由于低反应温度而节省了能量，通过从副产物甘油形成收益而减小了生产成本，并且几乎没有环境污染。然而，就稳定性和效率相对于成本而言，该酶是不佳的。已经提议将该酶固定化作为克服所述缺点的方式，但作为解决如何提高酶性质的问题的方案还很遥远。因此，正在进行积极的研究以通过增加该酶的酶活性来提高该酶的工业实用性。

例如，不是开发廉价的和强力的脂肪酶，而是已经使用间接的替代方式，诸如改良的用于脂肪酶和酶固定化的反应条件，来解决与脂肪酶相关的问题。可选地，已经使用宏基因组学来搜索新的脂肪酶，但还没有得到值得注意的成就。为了提高脂肪酶的活性以及它们的底物特异性、耐热性和热稳定性，已经进行了广泛的研究，其中已经收集了各种脂肪酶的X-线结晶学数据，并且已经通过下面的方式对脂肪酶进行修饰：使用蛋白质工程技术诸如定向诱变，置换活性位点和周围区域的氨基酸残基。尽管这带来了脂肪酶活性的提高，但提高仅是部分的。

发明内容

技术问题

鉴于此技术背景，本发明人想到造成脂肪酶与其底物的低可接近性的原因是底物的溶解度差，并且发现当与两亲性肽——即，具有亲水和疏水部分两者的肽——缔合时，脂肪酶与其底物的可接近性、结合性和反应性均提高，由此得到本发明。

解决问题的技术方案

因此本发明的目的是提供两亲性肽-脂肪酶缀合物，其表现出与单独脂肪酶相比更高的脂肪酶活性。

本发明的另一目的是提供编码所述缀合物的多核苷酸，包含所述多核苷酸的表达载体，以及其中包含所述表达载体的转化体。

本发明的又一目的是提供制备所述两亲性肽-脂肪酶缀合物的方法。

本发明的再又一目的是提供使用所述两亲性肽-脂肪酶缀合物的脂解方法。

本发明的再另一目的是提供使用所述两亲性肽-脂肪酶缀合物生产生物柴油的方法。

发明的有益效果

由于显著地提高了对脂类底物的反应性并且因此提高了酶活性，根据本发明的与两亲性肽缀合的脂肪酶，即使以小量使用，也能在需要脂肪酶的领域，诸如生物柴油生产中保证足够的脂类转化率。另外，本发明的脂肪酶缀合物不需要使用额外的表面活性剂，因此提供了经济效益。

附图说明