[发明专利]用于提高人乳头瘤病毒L1蛋白产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于提高人乳头瘤病毒（HPV）L1蛋白产量的方法。更具体的是，本发明涉及用于提高HPV L1蛋白产量的方法，其包括在含有高浓度总碳源的培养基中培养HPV L1蛋白表达细胞的步骤。

背景技术

宫颈癌是由人乳头瘤病毒（HPV）感染导致的[1]。每年大有约50万女性患宫颈癌，造成25万人死亡[2]。假定大多数女性在她们的生活中有时具有无症状的HPV感染[3,4]。16型HPV（HPV16）被认为是最主要的类型，因为50%以上宫颈癌病例和90%头颈癌都源于它[5]。L1蛋白占HPV病毒壳体的80-90%，且具有自我装配成病毒样颗粒（VLPs）的性质，所述病毒样颗粒的结构与天然存在的HPV病毒粒子的结构相似[6]。因此，已认为HPV VLPs的免疫可以有效地中和抗体[7]。目前，市场上可购买到两种基于VLP的预防疫苗。一种是Gardasil^TM(Merck)，其由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达系统产生，另一种是Cervarix^TM(GlaxoSmithKline)，其由昆虫细胞表达系统产生[8]。这些疫苗含有作为抗原的16型和18型HPV的VLPs，采用三次剂量的免疫方案且被认为理论上具有保护70%宫颈癌的作用，因为16型和18型HPV的感染是造成70%宫颈癌病例的主要原因[9]。或Cervarix^TM的零售价为大约每剂量$120，全系列$360[10]。现有HPV疫苗的高零售价限制了其广泛使用，并且由于其高零售价发展中国家无法担负[11]。因此，在HPV疫苗领域，需要优先考虑用于提高疫苗抗原L1蛋白产量的方法。

为了确保在生物制药生产过程的经济利益，在上游工艺生物反应器中产量的提高必须导向总产物产量的提高[12]。然而，几乎没有人重视这个原则，且几乎没有研究出通过优化重组HPV L1蛋白生产过程中的培养条件来提高产率。此外，比较不同培养条件下L1蛋白生产率的研究实际上特别困难，因为纯化HPV L1蛋白的方案耗时长、劳动强度大且成本高。最近，我们研发出用于由酿酒酵母生产的HPV L1蛋白的一步层析纯化方法，其适合于大规模生产HPV L1蛋白并可采用于多种样本[13]。

酿酒酵母的GAL10启动子是用于生产异构蛋白的最有力且最常用的启动子[14,15]。如果同时存在葡萄糖和半乳糖时，酿酒酵母优选使用葡萄糖，且葡萄糖系统被抑制时，半乳糖诱导GAL启动子[16]。因此，在GAL10启动子系统下，碳源的组成是生产重组蛋白最重要的因素[17-19]。通常，在酿酒酵母中生产L1蛋白需要48至72小时的培养时间和2%至4%的由葡萄糖和半乳糖组成的碳源[20–22]。然而，很少有报告的结果是通过改变培养基中碳源的浓度和组分提高HPV L1蛋白表达产率。

在本发明的说明书中，包括之前的报告和说明。之前报告和说明的内容包括在当前内容中，且这些参考阐明本说明书的内容。

发明内容

技术问题

本发明人试图研究在用于表达HPV L1蛋白的细胞培养过程中提高HPV L1蛋白产量的方法。因此，本发明人证实了当使用含有高浓度碳源的培养基时，其碳源浓度高于常规使用的碳源浓度，HPV L1蛋白的产率显著提高。此外，我们发现与在常规培养基中生产的LI蛋白相比，使用含有高浓度碳源的培养基显著提高了L1蛋白的免疫原性。这些结果表明使用含有高浓度碳源的培养基不仅提高了LI蛋白的产率，还提高了其免疫原性。

因此，本发明的目的在于提供通过使用含有高浓度碳源的培养基提高L1蛋白产率的方法。

通过以下本发明的详细描述、权利要求、实施例、表格和附图以提供本发明的有益效果和目的。

技术方案

根据本发明的一方面，本发明提供了提高HPV L1蛋白产量的方法，其包括在含有总碳源浓度为6%至14%的培养基中培养表达HPV L1蛋白的细胞的步骤。

根据本发明的另一方面，本发明提供了提高HPV L1蛋白产量的方法，其包括以下步骤：(a)制备含有总碳源浓度为6%至14%的培养基；及(b)将HPV L1蛋白表达细胞接种于培养基中并在培养基中培养HPV L1蛋白表达细胞。