[发明专利]用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法

说明书

本发明涉及用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法，所述方法包括步骤：a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液；b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应，所述试剂盒包含‑碳青霉烯酶底物，选自碳青霉烯和头霉素，‑pH颜色指示剂，当反应混合物的pH为6.4‑8.4时，所述pH颜色指示剂将改变颜色，其中步骤b)后的颜色变化表示所述测试样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌。本发明还涉及试剂盒、涉及微量滴定板以及涉及它们在检测样品中存在碳青霉烯酶产生者中的用途。

发明领域

本发明涉及用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法。

发明背景

在全世界越来越多地鉴定产生碳青霉烯酶的细菌分离物(即碳青霉烯酶产生者)(1-3)。它们的早期检测成为预防其传播并且保存成为用于治疗严重感染的最后依靠的抗生素的碳青霉烯的功效的临床微生物学范围的主要问题(4)。事实上，碳青霉烯酶通常与许多产生多药耐药性和泛耐药性的其他非β内酰胺耐药决定因素相关。此外，由于现有人群的交换和移动，碳青霉烯酶产生者的早期识别成为强制性的，无论多药耐药的医院感染采取哪一种抗生素政策或速度。

大多数已获得的碳青霉烯酶属于β内酰胺酶的四种已知种类的三种，即安布勒A类、安布勒B类(金属β内酰胺酶(MBL))和安布勒D类(苯唑西林酶(OXA))。这三类碳青霉烯酶为碳青霉烯赋予显著的临床耐药性或为碳青霉烯赋予降低的易感性(1-4)。因此，来自这三类碳青霉烯酶的产生碳青霉烯酶的细菌分离物已经同时涉及医院和社区获得性感染。

三类不同的碳青霉烯酶的传播在全世界显著不同。例如，KPC产生者(安布勒A类)大多数在美国和南欧鉴定，而IMP、VIM、NDM-1(安布勒B类)在全世界广泛鉴定，其中NDM-1的主库在印度次大陆。至于OXA-48-样酶(安布勒D类)，其至少在地中海海岸的南部和东部且最近在欧洲鉴定(5)。

目前，存在两种检测碳青霉烯酶产生者的方法。第一，可以使用体内产生碳青霉烯酶的基于表型的技术，例如和“Hodge测试”(4)。是一种测定许多微生物的抗菌易感性的定量技术。该系统包含用于测定抗微生物的不同的抗菌剂的最低抑菌浓度(MIC，μg／mL)的预定义的抗生素梯度，所述最低抑菌浓度在琼脂培养基上采用过夜培养来测试。至于“Hodge测试”，当分离物产生酶并允许碳青霉烯易感菌株向着碳青霉烯圆盘生长时，检测到碳青霉烯酶产生。“Hodge测试”的结果是特有的苜蓿叶样缺口。然而，令人遗憾地，这些基于表型的技术既不灵敏也不足以特异性。在很多情况下，已经报告假阳性。或者，可以使用用于碳青霉烯酶的分子检测技术。然而，该技术仍然相当昂贵，且需要极度的专业知识。基于表型的技术和分子检测技术的最终缺点都是它们是耗时的(12到24h)，因此不满足实施避免医院疾病爆发的发展的预防分离测量所需的临床要求(4)。

之前的工作采用显色头孢菌素例如头孢硝噻吩和CENTA进行β内酰胺酶鉴定(6，7)。然而，这些显色底物分子不能特异性检测碳青霉烯酶；它们检测任何β内酰胺酶，不管其水解特征。至于Cica-β测试，该测试采用显色头孢菌素HMRZ-86以及特异性抑制剂。尽管该测试可以检测MBL产生者，但是它还需要培养步骤。事实上，病原体首先必须在适当的非选择性培养基上分离，然后进行测试。然后，仅使用分离的菌落以避免污染和确保生物体是纯的。已经使用其他测试，例如采用苄青霉素作为底物的碘量滴定的测试和酸量滴定的测试，但是对于检测碳青霉烯酶也是非特异性的(6)。最后，采用包含淀粉琼脂的亚胺培南的技术也用于检测MBL活性(8)。然而，这最后一种技术需要蛋白质萃取、部分β内酰胺酶纯化、电泳迁移以及β内酰胺酶领域的广泛知识。因此，它是耗时的且通常仅保留用于研究目的。

为促进临床微生物学领域内碳青霉烯酶产生者的检测，申请人开发了一种基于简单的酸比色技术的新方法。该方法基于以下概念：通过水解碳青霉烯酶底物的β内酰胺环，碳青霉烯酶产生羧基，其反过来酸化介质。然后，由该水解产生的酸性通过pH颜色指示剂的颜色变化来鉴定(9)。