[发明专利]蛋白质唾液酸化的快速和准确分析

说明书

技术领域

本发明描述的是用于分析蛋白质唾液酸化的分析方法。

背景技术

许多蛋白质行使它们的生物学功能需要糖基化。通常，末端，“加帽”，糖基链的碳水化合物是唾液酸残基。唾液酸包括一个N-和O-连接的神经氨酸家族。N-连接的唾液酸通过将乙酰基或羟乙酰基部分连接到神经氨酸的氨基酸残基而形成，分别形成N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。如果神经氨酸的氨基被羟基基团取代，这会产生3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖-2-非酮糖（nonulosonic）酸（KDN）。O-连接的唾液酸是用甲基，乙酰基，乳酰基，硫酸，或磷酸基团取代Neu5Ac，Neu5Gc，或KDN的一个或多个羟基而形成。因此，存在大量且不同种类的唾液酸。

此外，一般来说，由于这些修饰的许多生物学功能，有相当大的兴趣来分析蛋白质唾液酸化作用。唾液酸化作用对药代动力学和蛋白质生物疗法的功效是重要的。因此，已研发了一些分析方法用来评估糖蛋白的唾液酸含量。例如，基于抗体的测定方法可用于确定特定的碳水化合物部分。末端唾液酸残留可以从目标糖蛋白进行酶分离并通过HPLC分析。然而，这些方法都有缺点且通常需要纯的样品或高的浓度。生物制药行业使用的常规方法的精确度低，数据可变性高，且由于基质干扰它们并不能应用于复杂的培养基。本发明所述的方法克服了这些缺点并提供了蛋白质唾液酸化作用的准确和可重复的定量。

总的来说，本发明所述的方法包括两个步骤：（1）使用酶促反应来水解来自糖蛋白的半乳糖和唾液酸残基；和（2）使用离子交换色谱方法来分离和定量半乳糖残基。该方法的酶促反应部分涉及在特异性的外-糖苷酶，β-(1-4)-半乳糖苷酶（β-半乳糖苷酶）作用下暴露的（未加帽的）末端半乳糖残基的释放，而末端唾液酸残基在α-(2-3,6,8,9)唾液酸酶（α-唾液酸酶）作用下释放。消化之前，将样品至少分为三管。第一管，反应A，是背景样品，并且仅包括酶促反应缓冲液。第二管，反应B，与能够切割所有未由唾液酸加帽的半乳糖残基的β-半乳糖苷酶反应。第三管，反应C，与唾液酸苷酶和β-半乳糖苷酶共同消化。唾液酸苷酶除去加帽的唾液酸并允许β-半乳糖苷酶切割所有暴露的半乳糖残基。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAECPAD）用于测定三个样品中存在的半乳糖的量。未加帽的半乳糖（即，反应B）与总的半乳糖（即，反应C）的比值用来计算半乳糖残基的加帽百分比，同时也计量培养基（反应A）中存在的任何游离半乳糖。

发明内容

本发明提供了一种用于分析蛋白质的唾液酸化的方法。

本发明也提供了一种用于测定蛋白质的唾液酸含量的方法，其包括：（a）制备用于分析的蛋白质；（b）酶处理制备的蛋白质，包括：将制备的蛋白质分成多个蛋白质样品，包括（i）至少一个蛋白质样品作为培养基样品（反应A）；（ii）在至少一个蛋白质样品中加入至少β-半乳糖苷酶（反应B）；（ⅲ）在至少另一个蛋白质样品中加入至少β-半乳糖苷酶和α-唾液酸酶（反应C）；并孵育多个蛋白质样品；以及（c）利用HPAEC-PAD色谱法分析多个蛋白质样品；（d）测定多个蛋白质样品的碳水化合物含量；和（e）计算蛋白质的唾液酸化百分比。

本发明还提供了一种方法，其进一步包括：（f）利用HPAEC-PAD色谱法分析多个阳性和阴性对照；（g）利用HPAEC-PAD色谱法分析多个标准品；以及（h）将多个蛋白质样品与多个标准品和对照进行比较。

本发明也提供了用于测定蛋白质的唾液酸含量的HPAEC-PAD色谱法的应用，其包括：（a）制备用于分析的蛋白质；（b）酶处理制备的蛋白质，包括：将制备的蛋白质分成多个蛋白质样品，包括（i）至少一个蛋白质样品作为培养基样品（反应A）；（ii）在至少一个蛋白质样品中加入至少β-半乳糖苷酶（反应B）；（ⅲ）在至少另一个蛋白质样品中加入至少β-半乳糖苷酶和α-唾液酸酶（反应C）；并孵育多个蛋白质样品；以及（c）利用HPAEC-PAD色谱法分析多个蛋白质样品；（d）测定多个蛋白质样品的碳水化合物含量；以及（e）计算蛋白质的唾液酸化百分比。

本发明还提供了一种应用，其进一步包括：（f）利用HPAEC-PAD色谱法分析多个阳性和阴性对照；（g）利用HPAEC-PAD色谱法分析多个标准品；以及（h）将多个蛋白质样品与多个标准品和对照进行比较。