[发明专利]用于增强植物中组成型基因表达的调节性核酸分子

说明书

发明描述

本发明属于植物分子生物学领域并且提供了用于产生高表达的组成型启动子和产生具有增强的核酸组成型表达的植物的方法，其中将增强核酸表达的核酸(NEENAs)与所述启动子功能性连接和／或导入植物中。

转基因在植物中的表达强烈地受多种外部和内部因素影响，从而导致变动和不可预测水平的转基因表达。经常不得不产生大量的转化体并进行分析，以鉴定具有合乎需要的表达强度的株系。由于转化并筛选表达强度合乎需要的株系是昂贵和耗费人力的，故需要一个或多个转基因在植物中高表达。当不得不在转基因植物中协调表达几个基因以实现特定效应时，鉴于必须鉴定其中每个基因均强烈表达的植物，这个问题尤其严重。

例如，取决于构建体设计和各个转化事件中T-DNA插入基因座的位置效应，转基因的表达可以显著地变动。强启动子可以部分地克服这些难题。然而，显示强烈表达同时特异性合乎需要的合适启动子的可获得性经常是有限的。为了确保可获得具有合乎需要的表达特异性的充足启动子，额外启动子的鉴定和表征可能有助于弥合这种缺口。然而，具有相应特异性和强度的启动子的天然可获得性和费时的候选启动子表征阻碍了合适的新启动子的鉴定。

为了克服这些难题，已经显示多样的遗传元件和／或基序积极地影响基因表达。在它们当中，已经认可一些内含子作为具有改善基因表达的强大潜能的遗传元件。虽然机制大多未知，但是已经显示一些内含子积极地影响成熟mRNA的稳态量，这可能通过增强转录活性、改善mRNA成熟、增强胞核mRNA输出和／或改善翻译起始来影响(例如Huang和Gorman，1990；Le Hir等人，2003；Nott等人，2004)。由于显示仅所选的内含子增加表达，故剪接本身很可能解释不了观察到的效果。

将内含子与启动子功能性连接时观察到的基因表达增加称作内含子介导的基因表达增强(IME)并且已经在多种单子叶植物(例如Callis等人，1987；Vasil等人，1989；Bruce等人，1990；Lu等人，2008)和双子叶植物(例如Chung等人，2006；Kim等人，2006；Rose等人，2008)中得到显示。在这个方面，显示内含子相对于翻译起始位点(ATG)的位置对于内舍子介导的基因表达增强至关重要(Rose等人，2004)。

继一些内含子增强基因表达的潜能之后，显示这些内含子还在植物中于其原有核苷酸环境下影响组织特异性。发现报道基因表达依赖于含有多达2个内含子的基因组区域的存在(Sieburth等人，1997；Wang等人，2004)。也已经报道5’UTR内含子对启动子元件的恰当功能性是重要的，这可能归因于内含子中存在的组织特异性基因控制元件(Fu等人，1995a；Fu等人，1995b；Vitale等人，2003；Kim等人，2006)。然而，这些研究还显示内含子与异源启动子的组合可能对基因表达的强度和／或特异性产生强烈的不利影响(vitale等人，2003；Kim等人，2006、WO2006／003186、WO2007／098042)。例如，通过与芝麻SeFAD25’UTR内含子组合而不利地影响花椰菜花叶病毒CaMV35S组成型强启动子(Kim等人，2006)。与这些观察结果相反，一些文献显示通过IME增强核酸的表达而不影响相应启动子的组织特异性(Schünmann等人，2004)。

在WO／2011／023537和WO／2011／023539中，作者描述了一些核酸分子，当其功能性连接启动子时，增强这些启动子的表达而不影响相应启动子的特异性。

在本申请中，描述了与组成型启动子功能性连接时增强所述启动子的表达同时不影响其特异性的其他核酸分子。在本申请中将这些核酸分子描述为“增强核酸表达的核酸”(NEENA)。内含子具有从相应的前mRNA剪接下来的内在特征。与其相反，本申请中即将陈述的核酸不必要一定包含于mRNA中，或如果存在于mRNA中，没有必要一定从mRNA中剪接下来，以增强源自与NEENA功能性连接的启动子的表达。

发明详述

本发明的第一实施方案包括用于产生高表达的组成型启动子的方法，所述方法包括将启动子与一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)分子功能性连接，所述NEENA分子包括

i)具有如SEQ ID NO：1至14937和14958至14960的任一者中所定义序列的核酸分子，或