[发明专利]定量核酸酶保护测定（QNPA）和测序（QNPS）的改进

权利要求书

1.一种确定样品中至少一种靶核酸分子的序列的方法，包括：

使所述样品与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）在足以使所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触，

其中所述NPPF包含：

5′末端和3′末端，

与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列，使得所述NPPF和所述靶核酸分子之间能够特异性结合，

位于与所述靶核酸分子互补的序列的5′、3′或5′和3′的侧翼序列，其中所述侧翼序列包含未在所述样品中的核酸分子中发现的至少12个连续核苷酸，所述至少12个连续核苷酸提供了通用扩增序列，并且其中所述侧翼序列与扩增引物的至少一部分互补；

使所述样品与包含同所述侧翼序列互补的序列的核酸分子（CFS）在足以使所述侧翼序列特异性结合至所述CFS的条件下接触；

使所述样品与特异性针对单链核酸分子的核酸酶在足以除去未结合的核酸分子的条件下接触，从而产生包含与所述靶核酸分子和CFS杂交的NPPF的经消化的样品；

用所述扩增引物扩增所述经消化的样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子，其中至少一个扩增引物包含与所述NPPF的侧翼序列互补的区域；和

对所述NPPF扩增子的至少一部分进行测序，从而确定所述样品中至少一种靶核酸分子的序列。

2.一种检测样品中至少一种靶核酸分子的方法，包括：

使所述样品与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）在足以使所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触，

其中所述NPPF包含：

5′末端和3′末端，

与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列，使得所述NPPF和所述靶核酸分子之间能够特异性结合，

位于与所述靶核酸分子互补的序列的5′、3′或5′和3′的侧翼序列，其中所述侧翼序列包含未在所述样品中的核酸分子中发现的至少12个连续核苷酸，所述至少12个连续核苷酸提供了通用扩增序列，并且其中所述侧翼序列与扩增引物的至少一部分互补；

使所述样品与包含同所述侧翼序列互补的序列的核酸分子（CFS）在足以使所述侧翼序列特异性结合至所述CFS的条件下接触；

使所述样品与特异性针对单链核酸分子的核酸酶在足以除去未结合的核酸分子的条件下接触，从而产生包含与所述靶核酸分子和CFS杂交的NPPF的经消化的样品；

用扩增引物扩增所述经消化的样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子，其中至少一个扩增引物包含与所述NPPF的侧翼序列互补的区域；和

检测所述NPPF扩增子，从而检测所述样品中至少一种靶核酸分子。

3.权利要求1或2的方法，其中所述NPPF包含DNA分子。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述NPPF包含35-150个核苷酸。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列长度为10-60个核苷酸。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述侧翼序列长度为12-50个核苷酸。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述NPPF在5′末端和3′末端包含侧翼序列，其中所述5′末端的侧翼序列与3′末端的侧翼序列不同。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述至少一个扩增引物还包含一个序列，所述序列允许在所述扩增步骤中将实验标签或测序衔接头连接到NPPF扩增子。

9.权利要求1-7任一项的方法，其中所述侧翼序列还包含实验标签、测序衔接头或其两者。

10.权利要求8或9的方法，其中所述实验标签包含使得能够鉴定样品、受试者、处理或靶核酸序列的核酸序列。

11.权利要求8-10任一项的方法，其中所述测序衔接头包含允许捕获到测序平台上的核酸序列。

12.权利要求8-11任一项的方法，其中所述实验标签或测序标签存在于所述NPPF扩增子的5′末端或3′末端。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中一种或多种靶核酸分子是被固定、被交联或是不可溶的。

14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述样品是被固定。