[发明专利]用于产生有用代谢物的重组微生物

说明书

本发明涉及特征如下的重组微生物：具有磷酸转酮酶活性、与未修饰的微生物相比通过失活编码磷酸果糖激酶的基因或通过减少磷酸果糖激酶活性而具有削弱或失活的Embden-Meyerhof-Parnas途径(EMPP)或不具有磷酸果糖激酶活性，和与未修饰的微生物相比通过失活编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因或通过减少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性而具有削弱或失活的戊糖磷酸途径(PPP)氧化支路或不具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。这种微生物可以用于产生有用代谢物如丙酮、异丁烯或丙烯。

对于过去的数十年，代谢工程实践者已经致力于为生产化学品提供生物解决方案，由此为较传统的化学方法提供替代方法。通常而言，生物解决方案允许利用可再生原料(例如糖)并且与基于现有石油化学的方法竞争。一种用于生产化学品的多步骤生物解决方案一般包含微生物作为将原料转化成靶分子的催化剂。用于产生特定靶分子的全套酶反应可以划分成属于中心碳途径的那些酶反应和属于产物特异性途径的那些酶反应。属于中心碳途径和产物特异性途径的反应是关联的，原因在于必须在有助于该方法的竞争力总体权衡下考虑每种酶反应反应的氧化还原约束条件(一般是NAD(P)H)和能量学约束条件(一般是ATP)。历史上，已经将依赖糖生长的异养生物的中心碳途径描述为Embden-Meyerhoff-Parnas途径(EMPP)、戊糖磷酸途径(PPP)、Entner-Doudoroff途径(EDP)和磷酸转酮酶途径(PKP)(见Gottschalk(1986),Bacterial Metabolism,第2版，Springer-Verlag,New York)。每个中心途径或中心途径组合相对于特定靶分子提供优点和缺点。为了提供有竞争力的生物方法，已经描述了具有涉及EMPP，PPP和EDP的修饰的重组微生物(M.Emmerling等人,Metab.Eng.1:117(1999)；L.O.Ingram等人,Appl.Environ.Microbiol.53:2420(1987)；C.T.Trinh等人,Appl.Environ.Microbiol.74:3634(2008))。最近，已经描述了具有涉及PKP的修饰的重组微生物(见Sonderegger等人,Appl.Environ.Microbiol.70(2004),2892-2897，美国专利7,253,001，Chinen等人,J.Biosci.Bioeng.103(2007),262-269，美国专利7,785,858；Fleige等人，Appl.Microbiol.Cell Physiol.91(2011),769-776)。

EMPP将1mol葡萄糖转化成2mol丙酮酸(PYR)。当需要乙酰-CoA时，1mol PYR可以转化成1mol乙酰-CoA，同时生成1mol CO₂和1mol NADH。在方程式1中给出总反应。

葡萄糖+2ADP+2H₃PO₄+2CoA+4NAD⁺→

2乙酰-CoA+2CO₂+2ATP+2H₂O+4NADH+4H⁺

(方程式1)

PPP提供将1mol葡萄糖转化成1mol CO₂和2mol NADPH的手段，同时产生0.67mol果糖-6-磷酸(F6P)和0.33mol甘油醛-3-磷酸(GAP)。如此形成的F6P和GAP必须由其他反应途径代谢，例如由EMPP代谢。EDP将1mol葡萄糖转化成1mol GAP和1mol PYR，同时产生1mol NADPH。与PPP同样地，如此形成的GAP必须由其他反应途径代谢。PKP提供将1mol葡萄糖转化成1mol GAP和1.5mol乙酰磷酸(AcP)的手段。当需要乙酰-CoA时，1当量AcP加上1当量辅酶A(CoA)可以由磷酸转乙酰酶的作用转化成1当量乙酰-CoA和1当量无机磷酸(Pi)。

对于从借助PKP和相对于AcCoA部分在氧化还原中性附近产生的AcCoA部分所衍生的特定靶分子，存在总体能量平衡的缺乏。PKP(和类似地，PPP和EDP)不产生用于将葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸的ATP。在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依赖性葡萄糖摄取的情况下，必须通过其他手段(例如借助EMPP)产生PEP。借助PKP再循环GAP恶化这种情况，特别在产物特异性途径提供少量ATP时。