[发明专利]在单路或多路测定法中用于检测人细小病毒核酸和用于检测甲型肝炎病毒核酸的组合物和方法

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119要求2011年7月15日提交的美国专利申请No.61/508,597的优先权，将该专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及用于检测人传染性病原体的诊断方法和组合物，并且具体地讲涉及用于体外检测人细小病毒基因型1、2和3和/或甲型肝炎病毒的核酸的方法和组合物。

背景技术

多种治疗性蛋白质，包括凝血因子、免疫球蛋白(IVIG)以及白蛋白，是由如基立福(Grifols)、百特(Baxter)以及CSL之类的公司从人血浆中纯化而来的。检验细小病毒B19和HAV是重要的，因为它们是无包膜病毒，这使得这些病毒在纯化（分级分离）过程期间抗灭活。允许相对低水平的B19存在于血浆级分中（现行规定要求在可含有4,000至5,000个单独的血浆单位的制造池中低于10,000IU）。与其冒险集合成一个大型制造池而然后发现其污染有B19，通常用血浆分级分离器来筛选较小的池来鉴定含有高滴度B19的单独的血浆单位。目前不存在关于HAV的规定，但一般也执行检验，因为这样做已经变成一个行业标准。

人细小病毒（红细胞病毒属(Erythrovirus)）是一种血源性无包膜病毒，其具有约5.5kb的单链DNA(ssDNA)基因组（Shade等人，1986,J.Virol.（《病毒学杂志》）58(3):921-936；Brown等人，1997,Ann.Rev.Med.（《医学年评》）48:59-67）。单独的病毒粒子含有一个拷贝的基因组的正链或负链，以大致相等数目表现。该ssDNA基因组具有形成约350nt的5'和3'发夹的反向末端重复序列，所述反向末端重复序列为病毒复制所必需。该基因组在正链上包括两个开放阅读框，其编码结构蛋白（VP1和VP2）和非结构蛋白(NS1)。

曾经认为人细小病毒是高度保守的，遗传多样性小于2%。然而，近来已发现人红细胞病毒属分离株（最初称为V9）与B19相比在基因组序列方面具有大于11%的趋异性，其中最惊人的DNA不相似性>20%，是在p6启动子区域内观察到的。该V9分离株也被测定具有大于11%的临床存在率。现在人红细胞病毒属群体被分成三个不同的病毒基因型：基因型1(B19)、基因型2（A6样和LaLi样）以及基因型3（V9样）。（Servant等人，2002,J.Virol.（《病毒学杂志》）76(18):9124-34；Ekman等人，2007,J.Virol.（《病毒学杂志》）81(13):6927-35）。Servant等人将基因型1称为对应于细小病毒B19的病毒并将基因型2和3称为对应于细小病毒V9相关病毒的病毒。Ekman等人将基因型1-3称为都对应于细小病毒B19。本文为方便起见，将基因型1、2和3称为细小病毒基因型1、2和3或人细小病毒基因型1、2和3。不能精确检测所有细小病毒基因型的核酸检测测定法会导致许多血浆池仍污染有人细小病毒。因此，需要一种可检测人细小病毒基因型1、2和3的核酸检验。

人细小病毒感染可通过呼吸道传播或通过受感染的血液或血液制品而发生。受感染的个体可能不表现出症状，或具有传染性红斑(erythema infectiosum)症状，该症状包括轻度流感样症状、皮疹（“第五病”）、短暂性关节炎样关节疼痛（关节病）、溶血性贫血患者中的再生障碍性危象、持续性细小病毒感染以及约10%的由于胎儿死亡而造成的早期流产。因此，不能检测汇集的血浆样本中的细小病毒或不能诊断感染具有严重的后果。

此外，需要检测测定法提供检测灵敏性，该灵敏性使得能检测如可能在感染早期或在稀释或汇集的样本中出现的低滴度的病毒。可检测适当水平的污染的细小病毒核酸检测测定法可有助于在使用前从血液供给处移除受感染的捐献单位或受污染批次的汇集血浆。