[发明专利]植物转化方法

说明书

本发明涉及产生转基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步骤：a)提供包含下胚轴或其部分、至少一个子叶和损伤组织的损伤的可转化外植体，b)转化所述外植体包含的细胞，和c)将所述外植体转移到包含针对选择标记的至少一种选择化合物的生长培养基上。此外，本发明涉及通过本发明的方法可获得的植物。

在1984年首次为烟草描述的农杆菌介导的植物转化目前广泛用于将基因导入植物中，用于基础研究以及产生商业使用的转基因作物的目的。能够成功转化的植物包括大部分主要的经济作物、蔬菜、观赏植物、药用植物、水果、树木和牧草植物。

植物转化主要通过农杆菌介导的植物转化来完成。农杆菌是天然存在的病原土壤细菌，其能够转移DNA进入植物细胞的基因组中。对于农杆菌介导的植物转化，将目的基因置于农杆菌T-DNA(转移DNA)的左边界和右边界重复序列之间。随后，使用合适的植物转化方案(对于综述参见Gelvin，2003Microbiol Mol Biol Rev.67(1)：16-37)将含有目的基因的T-DNA区稳定整合到植物基因组中。

除了农杆菌介导的植物转化之外，还存在其他植物转化方法，如病毒转化、植物原生质体的电穿孔和粒子轰击。

一般而言，植物转化技术基于相同的原理。在第一步中，将目的基因导入合适的转化载体中。随后将携带有目的基因的转化载体导入目标植物的再生细胞中。由于仅有一小部分的目标细胞接受了目的基因，因此在大量过量的未转化细胞中进行转化的植物细胞的选择。此外，一旦已经将目的基因稳定导入宿主细胞的基因组中，那么确定再生条件以从单个转化的植物细胞再生完整植株至关重要(参见例如Birch，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant MoI.Biol.48：297-326)。

最简单可用的基于农杆菌的植物转化方法之一是“浸花转化”。浸花是种系转化方法，通过所述方法可以将目的基因转化到产生种子的细胞中。该方法涉及在农杆菌细胞的悬浮液中浸泡植物(开花早期阶段)(Clough和Bent，1998，Plant J16：735-43)。浸泡后几周，收集浸泡植物的种子，并选择转化体的种子群体。浸花转化技术的优势是它避免使用成本密集并需要受过训练的工作人员的组织培养和植物再生。不幸的是，小的植物尺寸、短的世代时间以及每株植物大量的种子是用于浸花的必要条件。因此，该转化方法仅仅成功地应用于少数物种，主要用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)(但还有蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和芸苔(Brassica)，参见Wang等2003.Plant Cell Reports22：274-281)。

认为难以进行种系转化的完整转化植物的再生是植物转化中的瓶颈，这是由于再生难以实现，耗时并且需要特殊设备。

植物再生的第一步通常在体外条件下进行，即在无菌条件下的特殊营养培养基上。转化目标细胞后，通过特定的植物激素诱导细胞分裂，以从转化的植物细胞中生长出愈伤组织。愈伤组织诱导后，将所获的愈伤组织转移到允许枝条诱导的培养基上。将愈伤组织在所述培养基上培养(在体外条件下)直至形成枝条。枝条形成后，将枝条转移到允许根形成的培养基上(在体外条件下)。根形成后，一般将再生的小植株(即具有根的枝条)从体外条件转移到离体(ex vitro)条件下，主要转移到温室条件下的土壤中。因此，愈伤组织诱导、枝条诱导和根诱导一般均在体外条件下进行。

然而，体外条件下再生植物的当前方法具有一些缺点。在体外条件下再生完整植物花费高，并且需要特殊的营养培养基、特殊的设备和受过训练的工作人员。当然，常常存在污染的风险(例如，真菌污染)。如果组织培养受到污染，数周或甚至数月的工作可能都会前功尽弃。

然而，不采用组织培养，植物转化是有挑战的，这是由于组织培养

a)允许分别选择转基因植物细胞(和植物枝条)并且

b)同时抑制了细菌和真菌微生物的生长。不进行选择的话，难以鉴定携带转基因的植物细胞、植物枝条或小植株(即具有枝条和根的植物)。