[发明专利]制备人松弛素-2的方法

说明书

本专利申请涉及用于全合成松弛素-2的化学方法，其经药物处理(galenically process)成高纯度形式，供作为药物使用。

松弛素-2是属于胰岛素家族天然存在的肽激素(Schwabe和McDonald1977；Rinderknecht和Humbel1978)，可以从人体血流中分离(Wilkinson和Bathgate2007)。然而，这将意味着巨大的消耗，不能获得理想的和想要的产率，另外将难以提供可比的质量和纯度的材料。

松弛素-2在人体内的生理功能是控制心血管和/或肾系统、以及血管的血管舒张调节(Sherwood2004)。它与G蛋白偶联受体相互作用(参见图1）。

直至20世纪90年代，松弛素被认为仅是生育和孕激素：在怀孕的头三个月达到其最高血浆水平，并在胚胎着床和泌尿生殖结缔组织重建中发挥重要作用。

自2000年以来，科学家们已经研究了松弛素的心血管效应，尤其是在慢性心脏衰竭的作用。

研究已经首次表明存在组成型表达的内源性心脏和血管松弛素系统(Dschietzig等，2006)。在心脏衰竭中，心肌松弛素系统是处于受激状态，因此，发现循环松弛素水平显著增加，当血流动力学改善时其迅速下降。

因此，得到的结果显示1)存在功能相关的内源性心血管松弛素系统和2)心脏衰竭时松弛素的代偿作用。

如同胰岛素，松弛素-2由通过两个二硫键互连的两个不同多肽链(A和B)构成(Bourell等，1990)。

加工的人松弛素-2的氨基酸序列

A链:

pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys

线形A链的分子量:2656.2道尔顿(理论上)

B链:

Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser

线形B链的分子量:3312.9道尔顿(理论上)

人松弛素-2分子内的二硫键：

A链内：

Cys-10和Cys-15

连接A链和B链：

A链的Cys-11和B链的Cys-11

A链的Cys-24和B链的Cys-23

二硫键连接分子的分子量：5963.1道尔顿(理论上)

5962.5(ESI-MS)

至今，仅能通过重组合成制备纯度足够的松弛素-2和松弛素家族的其他肽，但对于肽来说该方法繁琐且产率低(Breece等.,1995;Tang等.,2003).

至今，全化学合成一直伴随着大量反应步骤和高支出消耗，因此没有获得高产率(Bullesbach和Schwabe1991;Samuel等.,2007;Barlos等.,2010)。

对于药物制备，需要开发优化的合成策略，该策略能够符合所有情况下对于纯度、产率、再现性、经济效率和消耗的需求。

传统的合成策略是基于在松弛素-2分子内选择性引入三个二硫键，一方面这意味着巨大的化学试剂消耗，另一方面需要色谱纯化过程，这是在产生各二硫键后所必须的。

进而预计会导致产物的巨大物质损失。

针对产物的质量和经济方面，迄今为止已经实施的合成策略是不够的。

至今，化学合成描述为太难，从而无法生产市售的产品。迄今为止，化学合成已经与氨基酸缺失所致的高杂质水平以及和高成本相关。因此，为了应对不断增加的问题，需要提供高纯度形式的松弛素-2从而获得无副作用的药物制剂(galenic preparation)。

不同的制造商实施松弛素-2的重组合成，为临床前和临床检验和研究提供产品。但是，生产的消耗阻碍经济上合理的开发。