[发明专利]用于生产痘苗病毒的方法和组合物

权利要求书

1.一种用于生产痘苗病毒的方法，所述方法包括：

(a)通过使HeLa细胞与痘苗病毒以0.005-1.0噬斑形成单位(pfu)/细胞的感染复数(m.o.i.)接触，用痘苗病毒感染附着于表面的所述HeLa细胞；

(b)在具有高于7.1的pH的感染培养基中，培养受感染的细胞；和

(c)从培养物收获痘苗病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)过程中附着性HeLa细胞的密度是10⁴-10⁶个HeLa细胞/cm²。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)过程中附着性HeLa细胞的密度是约10⁵个HeLa细胞/cm²。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述HeLa细胞附着于单元体、细胞工厂、T-烧瓶、滚瓶或微载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述HeLa细胞附着于一个或多个塑料滚瓶容器。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一个或多个滚瓶包含至少168,000cm²的培养面积。

7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中在步骤(a)过程中的痘苗病毒的浓度是在10³-10⁵pfu/ml。

8.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(a)过程中的痘苗病毒的浓度是约10⁴pfu/ml。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述感染培养基的pH是高于7.2，且优选为约7.3。

10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中在36℃至37.5℃的温度、优选在37℃下进行步骤(a)和(b)。

11.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中进行步骤(b)持续40-80小时、优选约44小时的时段。

12.根据权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中生产至少50pfu痘苗病毒/HeLa细胞，优选生产至少75pfu痘苗病毒/HeLa细胞。

13.根据权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中所述培养基不包含下述的一种或多种：硫酸葡聚糖、PluronicF-68、聚山梨酯80和大豆水解物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养基不包含硫酸葡聚糖。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述培养基缺少硫酸葡聚糖、PluronicF-68、聚山梨酯80和大豆水解物。

16.根据权利要求1-15中的任一项所述的方法，其中所述培养基包含胎牛血清。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养基包含小于10%的胎牛血清。

18.根据权利要求1-15中的任一项所述的方法，其中所述培养基不包含血清。

19.根据权利要求1-18中的任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述m.o.i.是约0.01-0.5pfu/细胞，且优选为约0.02pfu/细胞。

19.根据权利要求1-18中的任一项所述的方法，其中使收获的病毒进行一个或多个纯化步骤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述纯化包括：用核酸酶处理所述收获的病毒以除去HeLa细胞核酸，和/或用蛋白酶处理所述收获的病毒以除去HeLa细胞蛋白。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述纯化包括切向流过滤步骤。

22.根据权利要求19-21中的任一项所述的方法，其中所述纯化包括肝素亲和色谱法步骤。

23.根据权利要求19-22中的任一项所述的方法，其中所述纯化包括膜吸收色谱法步骤。

24.根据权利要求1-23中的任一项所述的方法，其中所述痘苗病毒是痘苗病毒的IHD-J、Wyeth、Western Reserve或哥本哈根株。