[发明专利]外源双链RNA导入植物细胞的方法和组合物

说明书

相关申请的交叉引用

本申请声明了2011年8月16日提交的美国临时专利申请号61/523,877在美国法典119(e)标题35项下的优先权权益。

发明领域

本发明涉及RNA的方法和组合物，这些方法和组合物包括应用于外部植物部分，优选地为叶片的RNA配制品，其中该双链RNA被吸收至植物细胞中。

发明背景

许多食物来源是由作物产生的。环境条件诸如干旱和高温经常对作物生长和产量产生不利的影响。有害生物的压力也有实质性的负面影响。因此，能够抵御环境压力和/或有害生物挑战的植物是令人希望的。通过选择育种或者通过基因修饰能够得到对非生物和生物胁迫有耐性或抗性的植物。RNA干扰15（RNAi）能被用于生产耐或抗非生物和生物胁迫的经遗传改性的植物。

在过去的十年里，RNAi已经在多种植物、真菌、线虫、水螅、以及人类的生物体内被描述和表征。

Zamore（扎穆尔）和Haley（哈利）（2005）Science（《科学》）309,1519-24。在植物中的RNA干扰通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中称为压制（quelling）。转录后基因沉默的过程被认为是一种进化保守的细胞防御机制，该机制被用来防止外来基因的表达并且通常由不同的植物（flora）和动物（phyla）共享。Fire（菲尔）(1999)Trends Genet.（《遗传学趋势》）15,358-363。

当一种生物体识别双链RNA分子并且水解它们时，RNA干扰发生。

所产生的水解产物是19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段被叫做小干扰RNA（siRNA）或微RNA（miRNA）。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物体，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA（或其他的RNA）杂交并且导致RNA的水解。大多数植物miRNA显示了与它们的靶标mRNA的广泛碱基配对，并且引导它们的靶标mRNA的切割。Jones-Rhoades（琼斯-罗兹）等（2006）Annu.Rev.Plant BioI.（《植物生物学年鉴》）57,19-53；Llave（拉弗）等（2002）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）97,13401-10406。在其他例子中，干扰RNA可以结合至具有不完全互补性的靶标RNA5分子上，导致在没有mRNA降解的情况下的翻译阻抑。

通常，沉默植物基因的作用方式包括与切丁酶相关联的双链RNA（dsRNA），该切丁酶将dsRNA切成19-24bps长度的双链片段（siRNA）。可以有多于一种切丁酶，这取决于该生物体。Meister（麦斯特）和Tuschl（布施）,2004)。该siRNA典型地被降解为两条单链RNA（ssRNA），这两条单链RNA被称作过客链和引导链。RNA干扰沉默复合体（RISC复合体）载有引导链。RISC复合体与靶标mRNA相关联，该靶标mRNA与引导链具有部分的或完全的同源性。催化性RISC组分argonaute引起靶标mRNA的切割，以预防该靶标mRNA被用作翻译模板。Ahlquist P（斯特P）（2002）RNA依赖性RNA聚合酶、病毒、以及RNA沉默，《科学》296（5571）:1270-3。通过使用重组技术，RNAi途径在植物中被采用，该RNAi途径要求用载体转化植物，该载体包括DNA，当该DNA表达时产生与靶标基因同源或几乎同源的双链RNA。该靶标基因可以与内源植物基因或昆虫基因同源。如果该靶标基因是一种昆虫基因，该昆虫食用植物，由此摄入双链RNA，于是该昆虫的RNAi RISC复合体引起切割，并且靶向同源mRNA，导致致命性昆虫过程的破坏。

至今，植物重组技术是递送靶标基因的基因沉默的工具，无论是内源植物靶标基因还是植物有害生物体的靶标基因。一般地，植物是用DNA转化的，该DNA被合并入植物基因组，并且当表达时，该DNA产生双链RNA，该双链RNA与感兴趣的基因互补，该感兴趣的基因可以是内源植物基因或植物有害生物的必需基因。产生转基因和有益的植物特性的植物重组技术要求有重大的研究投入和发展，并且形成重大的障碍调控。通过对植物外部（诸如叶片、茎、和/或根表面）的外源应用，递送双链RNA至植物细胞中以调控外源基因表达的方法和配制品在本领域是未知的。此类方法和配制品代表了基因沉默技术的重大的进步。