[发明专利]筛选伴侣蛋白调节物的方法

说明书

发明领域

本发明涉及筛选参与诱导神经退行性疾病诸如阿耳茨海默病（Alzheimer’s disease）、帕金森病（Parkinson’s disease）和亨廷顿病（Huntington’s disease）的蛋白聚集的伴侣蛋白（chaperonin）调节物的方法，以及由此筛选的伴侣蛋白调节物用于预防和治疗神经退行性疾病的用途。

发明背景

神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病的代表性症状包括特定蛋白的聚集。蛋白聚集体(aggregate)抑制作为细胞中蛋白分解设施的蛋白酶体的作用，并抑制转运蛋白的转移。并且，它与其它转录因子聚集在一起并隔离（isolate）它们以改变基因转录。而且，它干扰线粒体的作用，从而诱导氧化应激以诱导细胞死亡。特别地，由于以上作用，它可对通过突触的神经信号转导造成副作用，并且它可诱导神经元死亡以造成脑功能的衰退。

最近，许多神经退行性疾病研究集中在使用自我吞噬去除已经形成的聚集体。有研究结果表明蛋白聚集体的特异性去除。然而，已知当细胞中存在能量不平衡时，自我吞噬通过分解其细胞器获得能量，且如果未正确达到控制，自我吞噬可引起细胞死亡。

公开内容

技术问题

因此，提供用于筛选控制伴侣蛋白的作用以通过抑制蛋白聚集起始来维持正确蛋白折叠的新的调节物的方法是本发明的目的。

问题的解决方案

作为研究的结果，发明人确定牛痘-相关激酶2（vaccinia-related kinase 2，VRK2）与分子伴侣之一伴侣蛋白的量和/或稳定性相关，并特别发现VRK2依赖于酶活性降解伴侣蛋白。在伴侣蛋白的降解过程中，泛素连接酶COP1复合体与VRK2相互作用。因此，确认这两种物质可充当筛选伴侣蛋白调节物的重要的靶，并完成了本发明。筛选的伴侣蛋白调节物可以是预防或治疗神经退行性疾病的有效活性成分。

因此，本发明的一个实施方案提供了筛选伴侣蛋白调节物的方法，其包含1）制备候选物质和VRK2；2）测量VRK2的表达量或激酶活性；以及3）用候选物质处理VRK2并测量VRK2的表达量或激酶活性的变化。

优选地，VRK2可以是来源于所有真核细胞包括人类的VRK2，且例如，它可具有登录号BAA19109的氨基酸序列。并且，优选地，它可由登录号AB000450的核苷酸序列编码。

优选地，伴侣蛋白可以是伴侣蛋白TRiC/CCT，更优选地，可以是CCT4（登录号NM_009837）。

伴侣蛋白的调节可以优选地增加或降低伴侣蛋白的量和/或稳定性。

候选物质未特别限制，它可包括可以增加或降低VRK2的表达量和/或酶活性的所有物质，且优选地，它可以是各种合成或天然物质，包括多肽、多核苷酸（反义RNA、siRNA等等）和化合物。

VRK2可以是野生型的，或者可被适当修饰以增加活性。例如，修饰的VRK2可以被适当的标签修饰，其中标签可以是GST、His、Flag、EGFP、DsRed1等等，且优选地，GST可在VRK2的N末端加标签。

在伴侣蛋白调节物是增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质的情况下，方法可优选在步骤3）之后还包括，4-1）如果与未处理的对照相比，VRK2的表达量或激酶活性降低，则鉴定候选物质为增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质。

VRK2的表达量或激酶活性可通过生物实验中通常使用的方法来测量，没有特定限制。例如，激酶活性的存在或程度可通过体外激酶试验来确认，但不限于此。

VRK2对应于负伴侣蛋白调节物，并通过以下实施例1确认负调节是基于VRK2的酶活性。因此，与处理前的表达量或酶活性相比，如果当候选物质被处理时VRK2的表达量或酶活性降低，则处理的候选物质可被判断为增加伴侣蛋白的量和/或稳定性的物质。

根据以上方法增加伴侣蛋白的量和/或稳定性的物质可优选是由单链siVRK2(D-004684-06,Dharmacon)(SEQ ID NO:1)和其互补链组成的双链siVRK2。

相反，在伴侣蛋白调节物是降低伴侣蛋白的量或稳定性的物质的情况下，方法可优选在步骤3）后还包括，4-2）如果与未处理的对照相比，VRK2的表达量或激酶活性升高，则鉴定候选物质为降低伴侣蛋白的量或稳定性的物质。