[发明专利]遗传修饰的噬菌体及其用途

说明书

本发明涉及遗传修饰的噬菌体及其在生产目的生物分子的方法中的用途。

技术领域

本发明涉及在生物学系统中生产目的生物分子的领域。具体而言，本发明涉及遗传修饰的噬菌体，及其为避免对培养基肉汤和/或细菌裂解物的噬菌体污染的用途。

背景技术

细菌细胞是用于生产生物分子尤其是靶蛋白质的首选系统。除了其它优点之外，细菌系统容易使用并且可以在有限的培养体积中快速生产大量的蛋白质。

最广泛且经常使用的细菌系统之一是噬菌体T7表达系统。该细菌系统描述于US4,952,496中。在该系统中，编码靶蛋白的基因被置于T7启动子控制下，并被转化进入到包含整合的λDE3溶原噬菌体的细菌宿主中，常常是大肠杆菌(E.coli)中。λDE3溶原噬菌体携带着编码处于lacUV5启动子控制下的T7RNA聚合酶的基因。当在包含IPTG的培养基中培养时，T7RNA聚合酶的表达被诱导，并且使得靶蛋白表达。

由于T7RNA聚合酶基因(T7基因1)被整合到Int基因序列内，λDE3噬菌体在其进入到溶菌期的能力方面具有缺陷。然而，在一些蛋白质的生产过程中并且在任何其它噬菌体缺乏下观察到细菌裂解，表明DE3噬菌体可以恢复其裂解特性。细菌裂解以及更甚者培养基肉汤中感染性噬菌体的存在很成问题，因为(i)它使得所生产的靶蛋白在一些应用中诸如例如药物应用中的使用大打折扣，(ii)为了去除任何微量噬菌体的去污染过程需要生产线的关闭和培养批次的完全更新，以及(iii)其极大降低重组蛋白的产率。

使用噬菌体的备选方法也有所描述：

WO03/050240描述了用于在宿主细胞中生产靶蛋白的表达系统，包含使用同源重组所整合的编码T7RNA聚合酶的基因。然而，由于T7RNA聚合酶基因的大小，以及由于同源重组不易于在所有大肠杆菌菌株中进行的事实(如Phue等，Biotechnology andBioengineering，101，831-836，2008中所提及)，WO03/050240的系统难以实施。因此，携带T7RNA聚合酶整合的转化细胞的数量仍然非常低或者得不到这些细胞。此外，使用同源重组时必需使用选择标记，以筛选包含T7RNA聚合酶基因整合的细菌。该标记对于另外的筛选步骤不是可用的并且对于菌株的最终使用是不希望有的。例如，常常使用的选择标记是抗生素抗性基因，但是推荐在生物药物生产中避免使用这些基因。因此，为了从该菌株中去除抗生素抗性基因需要额外的步骤，并且这不一定能够实现。

WO2008/139153描述了另一表达系统，其中宿主细胞以包含T7RNA聚合酶表达盒的质粒转化。然而，由于使用质粒，宿主细胞必须维持在选择条件下以确保它们仍然包含质粒。此外，质粒会频繁进行重组，这有损表达系统。

因此，需要生产目的生物分子的新方法，其中，当使用噬菌体时，培养物在生长或者蛋白质生产过程中不被感染性噬菌体污染或者不被无意裂解。

因此本发明提供遗传修饰的噬菌体，其在培养过程中不会恢复其裂解特性，由此使得目的生物分子的生产中无噬菌体污染。

发明内容

本发明的一个目标是遗传修饰的噬菌体，其中

-表达系统被插入，

-S和/或R基因被灭活。

在本发明的一个实施方案中，Int和/或Xis基因被灭活。

本发明的另一个目标是遗传修饰的噬菌体，其中

-表达系统被插入，

-S、R和/或Q基因被灭活，和

-Int和/或Xis基因被灭活。

在本发明的另一个实施方案中，Rz基因被灭活。