[发明专利]处理凝血因子的方法

说明书

发明背景

发明领域

本申请涉及用于纯化重组凝血因子蛋白（包括例如凝血素（因子II））的方法。在实施例中，这些方法提供了纯化的凝血素，该纯化的凝血素展示出增加的生物活性和降低的凝血酶水平，由此增加凝血素的安全性。还提供了纯化的重组凝血因子蛋白。

发明背景

用于治疗应用（例如，用于血友病以及其他血液障碍的治疗）的凝血因子可以从人血浆中获得，尽管纯化可能是复杂的。即使伴随血液衍生蛋白产品的大量的安全性测量和测试，但是不能排除感染性病毒或朊病毒的污染。因此，高度令人希望的是从没有动物衍生组分的培养基中生长的重组细胞中产生人类治疗性蛋白质。因为许多蛋白质需要一个哺乳动物宿主来以全功能形式产生，即需要被正确地翻译后修饰，所以这常常不是简单的。

因子II（凝血素）是血液凝固所必需的一种凝血因子。在外部的（或组织因子）血液凝固通路中，组织因子触发凝固级联，其中在因子Xa、因子Va、磷脂、以及Ca²⁺离子的存在下，凝血素变为活化型因子IIa（凝血酶）。凝血酶通过多个通路发挥作用以通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白凝块以及参与其他前凝固通路来阻止流血。

在重组凝血素蛋白的生产和纯化过程中，凝血酶可以作为一种产物相关的杂质存在。游离凝血酶的水平大体上必须被保持在低水平以增加产品安全性。另外，重组凝血素在N端结构域中包含10个γ-羧基谷氨酸“Gla-残基”。这些残基被认为螯合Ca²⁺离子，这介导蛋白质与磷脂膜的结合，这是凝血素激活为凝血酶的先决条件。

本申请的诸位发明人已经认定了对于提供具有高水平的γ-羧化谷氨酸残基和低凝血酶污染的重组纯化凝血素的纯化方法的需要。

优选实施方案概述

本申请提供了凝固蛋白的纯化方法，以满足以上认定的需要。

在实施例中，提供了用于纯化重组凝血因子蛋白的方法。这些方法适合地包括提供一种混合物，该混合物包括该重组凝血因子蛋白。通过至少一个第一柱将该混合物进行过滤，以产生第一柱产物。通过聚(乙烯亚胺)（PEI）柱将该第一柱产物进行过滤，以产生PEI柱产物，并且回收纯化的重组凝血因子。适合地，该纯化的重组凝血因子蛋白包括小于约0.5/10的丢失γ-羧化的谷氨酸位点。在实施例中，该重组凝血因子蛋白是凝血素（因子II）。

适合地，该混合物是一种来自生物反应器的过滤混合物。在示例性实施例中，该混合物的过滤包括通过一个第一阴离子交换柱的过滤，适合地是一种结合和洗脱过滤。在实施例中，可以通过一个第二阴离子交换柱将该第一柱产物进行过滤，适合地是一种流经过滤。

在实施例中，在通过聚(乙烯亚胺)柱进行过滤之前，用溶剂/洗涤剂灭活将该第一柱灭活。在实施例中，通过聚(乙烯亚胺)柱的过滤是一种结合和洗脱过滤。适合地，通过疏水作用柱（HIC）将该PEI柱产物进行过滤，例如以一种结合和洗脱过滤方式。在实施例中，在回收之前，这些方法可以包括纳米过滤。

在适合的实施例中，该重组凝血素蛋白基本上不含凝血酶，并且包括小于约0.8/10、0.7/10、0.6/10、0.5/10或0.4/10的丢失γ-羧化的谷氨酸位点。

在另外的实施例中，提供了用于纯化重组凝血因子蛋白（例如，凝血素（因子II））的方法。这些方法适合地包括：提供一种包括该重组凝血因子蛋白的混合物，并且通过至少一个第一阴离子交换柱将该混合物进行过滤（例如，一种结合和洗脱过滤），以产生第一阴离子交换柱产物。用溶剂/洗涤剂病毒灭活将该第一阴离子交换柱产物灭活，以产生灭活的混合物。适合地，通过聚(乙烯亚胺)（PEI）柱将该灭活的混合物进行过滤（例如，结合和洗脱过滤），以产生PEI柱产物，并且通过疏水作用柱（HIC）将该PEI柱产物进行过滤，以产生HIC产物。在实施例中，然后将该HIC产物进行过滤（例如，纳米过滤）并且回收纯化的重组凝血因子蛋白。在实施例中，该纯化的重组凝血因子蛋白包括小于约0.8/10、0.7/10、0.6/10、0.5/10或0.4/10的丢失γ-羧化的谷氨酸位点。在某些实施例中，在通过PEI柱进行过滤之前，通过一个第二阴离子交换柱将该第一阴离子交换柱产物进行过滤（例如，流经过滤），以产生第二阴离子交换柱产物。然后，通过PEI柱将该第二阴离子交换柱产物进行过滤，以产生PEI柱产物。

适合地，该重组凝血素蛋白基本上不含凝血酶，并且适合地包括小于约0.8/10、0.7/10、0.6/10、0.5/10或0.4/10的丢失γ-羧化的谷氨酸位点。