[发明专利]通过序贯多元酸沉淀进行的血浆蛋白分级分离

说明书

本发明的技术领域

本发明涉及血液组分的分离。具体而言其涉及用于将血浆分级分离成药学上有用的组分的方法。

发明背景

用于大分子分离和纯化的非色谱法

来自天然来源的血浆蛋白的生产者长期依赖于基于乙醇的差异蛋白质沉淀以在经由柱色谱法纯化各蛋白质之前序贯地分离蛋白质级分。这类方法尤其适于以密集型生产经济运行的较大规模分离。然而，它们为技术上复杂的并且需要高度培训的技术人员以及昂贵的设备和设施。

涉及生物技术分离过程的科学家正在处理甚至更大型的过程以及对于降低生产产品的成本的需要。他们重新检验诸如双水相体系中的沉淀和分配等技术的用途(1, 2, 3)。分配的主要优点为其基于两个液(L)相的形成，由此可在L-L相界面收集细胞和细胞碎片，所述细胞和细胞碎片通过界面张力维持在所述界面。因此，如果靶蛋白可以选择性方式显著程度地分配到一相中，则可能全在一步中实现某种程度的靶标澄清(细胞碎片去除)、纯化和浓缩(上述参考文献)。分配的主要缺点为含水聚合物两相体系的形成通常需要向含有靶标的溶液中加入诸如葡聚糖和聚乙二醇[PGE]等两种聚合物或者加入一种聚合物和一种高浓度盐(例如PEG和0.5 M磷酸盐)。所述双聚合物体系可以是昂贵的而聚合物-盐体系具有低容量(溶解性)——对于抗体蛋白而言常常为1-2 g/L (3)。最近公开了通过加入相对低浓度的单种生物相容性向温聚合物来澄清生物技术原料的方法(4)，其允许经由基本上无聚合物相的形成来澄清，所述相包含大部分蛋白质，并且通常漂浮于密度更大的富含聚合物的下相之上。亦可经由添加沉淀剂来改良上相以实现靶标的进一步浓缩和纯化。

单聚合物双水相体系

早已知道蛋白质可在含水聚合物两相体系的相之间选择性分配，所述体系使用两种聚合物(例如葡聚糖和聚乙二醇)或一种聚合物(例如PEG)和相对高浓度的水构造盐(water structuring salt)(例如磷酸钠)自发形成。后一种体系更不昂贵但是它们趋于具有更低的蛋白质溶解性并因此具有更低的容量(3,4)。亦早已理解的是，细胞和细胞碎片，以及其它微米级胶体，趋于蓄积在两相的界面，它们通过界面张力维持在所述界面。上述两种类型的LL体系的一个变型为聚合物-聚合物体系，其中一种聚合物为热响应性聚合物，其在升高的温度和其它条件下自缔合(3,4)。先前将此行为用于在相分离和两相离析之后从一相的聚合物中分离蛋白质，并回收相聚合物以再使用。除所述两种类型的相体系之外，还已认可第三种类型——单聚合物体系。这些体系在这样的条件下形成，其中加入的亲水聚合物自缔合并因此形成较轻的贫聚合物相，其漂浮于密度大得多的富聚合物相之上(4,5)。合适的聚合物包括制备自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)组分的所谓的“EOPO”聚合物(例如Pluronic?、Tergitol?、Breox?家族)。其它合适的聚合物可包括用含乙氧基的基团二级修饰的纤维素或其它多糖聚合物。从生物分离角度来看，这类单聚合物低盐两相体系的主要缺点为蛋白质趋于不以任何选择性分配到上(贫聚合物)相中。因此已写到“水-EOPO体系因此仅适于疏水分子的分配(例如变性蛋白或富含色氨酸的肽或者用于通过选择性水去除进行的溶液浓缩)”(5)。一个可能的理论解决方案为疏水地修饰EOPO聚合物(6)，然而其可能导致去污性和其它复杂状态。最近发现，EOPO聚合物可直接加入发酵液中，利用发酵温度和盐来实现两相体系的形成，其中细胞碎片会集中在相界面而诸如蛋白质等可溶性物质会分配到贫聚合物相中，在所述相中其可随后容易地进行过滤和色谱分离(4)。一般而言此项工作聚焦于与重组蛋白相关的发酵以及具体而言聚焦于单克隆抗体生产。

蛋白质沉淀

尽管已提出将絮凝和沉淀(在本文中认为等同的术语)用于细胞碎片去除(2)，但它们亦对加工生物过程原料具有某些吸引力，所述生物过程原料使用离心随后过滤的经典方法预澄清(1,2,7-12)。在所述情况下，靶标纯化可能受到诸如宿主细胞蛋白质(HCP)等污染物沉淀的影响。幸运的是大多数单克隆抗体以及血液中许多天然存在的抗体在pH 7时带净正电荷，而许多HCP和核酸污染物带净负电荷(7)。因此聚阳离子聚合物可用于使许多HCP和核酸污染物沉淀，将带净正电荷的靶单克隆抗体(Mab)蛋白留在溶液中(8,10)。或者可能希望使用带净负电荷的聚合物使带净正电荷的Mab靶标沉淀并将带净负电荷的蛋白质和核酸留在溶液中(7-9)。在两种情况下均需要某种形式的过滤、离心或其它方法以从上清液中分离沉淀(11)。