[发明专利]通过与TaqMan探针组合的多重PCR从单一抗体产生细胞中获得Fab片段的方法

说明书

在本文中报道了通过组合多重聚合酶链式反应（PCR）和TaqMan探针，从单一抗体产生细胞中获得抗体的方法，以允许PCR产物的快速筛选。通过体外翻译，可以获得各个抗体的Fab片段，并且可以测定Fab片段的结合性质。

发明背景

随着杂交瘤技术的建立（Cole,S.P.C.,等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；和Boerner,P.,等人,J.Immunol.147(1991)86-95），单克隆免疫球蛋白已经在科学研究、人类保健和诊断学中发挥着关键的作用。因此，单克隆（特别是治疗性）免疫球蛋白的产生是一个进行了大量研究的领域。在这方面，其中杂交瘤技术和噬菌体展示技术（Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.,等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597）是用于单克隆免疫球蛋白产生的两种最常见技术。在杂交瘤技术中，稳定克隆的获得是需要克服的障碍，因此，减少抗体的多样性，使得仅有限数量的B细胞可以成功地融合、增殖，以及随后的被表征。相似地，基于噬菌体或酵母展示的组合文库方法的缺点是免疫球蛋白重链和轻链的随机配对。原始重链和轻链对的分离以及非同源配对（non cognate pairing），需要筛选大量免疫球蛋白产生细胞以鉴定高亲和力的重链和轻链对。此外，此类非同源对可能显示出与人抗原的不想要的交叉反应。最后，由于固有的选择偏倚，通过选择和筛选组合文库鉴定的靶特异性免疫球蛋白的遗传多样性通常是受限制的。

可以根据本领域已知的方法从免疫球蛋白产生细胞中产生免疫球蛋白。此类方法是例如杂交瘤技术。不同的方法是基于免疫球蛋白的核酸序列的鉴定。通常，所述方法足以鉴定可变区或者甚至仅CDR区或者仅CDR3区的序列。例如，mRNA分离自免疫球蛋白产生细胞库，并用于构建编码免疫球蛋白的CDR区的cDNA文库。然后，将cDNA文库转染到合适的宿主细胞，例如NS0或CHO中，并用于筛选特异性免疫球蛋白产生。

WO2008/104184报道了用于克隆同源抗体（cognate antibody）的方法。Tiller等人（Tiller,T.,等人,J.Immunol.Meth.329(2007)112-124）报道了来自单个人B细胞的单克隆抗体的有效产生。Braeuninger等人（Braeuninger,A.,等人,Blood93(1999)2679-2687）报道了来自T细胞富集的B细胞淋巴瘤的单个B细胞分子的分析。Rohatgi等人（Rohatgi,S.,等人,J.Immunol.Meth.339(2008)205-219）报道了嵌套式（RT-）PCR引物的系统设计和测试。在WO02/13862中，报道了改变B细胞介导的病理的方法和组合物。Haurum等人（Meijer,P.J.和Haurum,J.S.,J.Mol.Biol.358(2006)764-772）报道了一步RT多重重叠延伸PCR（one-step RT-multiplex overlap extension PCR）。Stollar等人和Junghans等人通过单细胞PCR反应报道了序列分析（Wang,X.和Stollar,B.D.,J.Immunol.Meth.244(2000)217-225；Coronella,J.A.和Junghans,R.P.,Nucl.Acids Res.28(2000)E85）。Jiang,X.和Nakano,H.,等人（Biotechnol.Prog.22(2006)979-988）报道了用于体外转录和翻译的线性表达元件的构建。

发明概述

已经发现，通过组合在反转录和基因特异性聚合酶链反应中所需的引物，以及在多重单管实时聚合酶链反应中实时定量所需的探针，可以改进（例如变得更快和更强）通常使用的用于获得编码同源（cognate）VH和VL的核酸的多步骤方法。

在一个方面，在本文中报道了用于多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应的方法，所述聚合酶链反应用于从单个B细胞或成浆细胞或浆细胞中扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸（人IgG同种型），所述方法包括以下步骤：

-用第一和第二5’-引物以及第一和第二3’-引物以及第一和第二TaqMan探针，在一个步骤中进行反转录和聚合酶链反应。