[发明专利]用于基因治疗载体的表达的杆状病毒系统

说明书

本发明涉及利用单次感染即可用于表达基因治疗载体的重组杆状病毒基因组。

重组腺相关病毒（或rAAV）目前被认为是基因治疗中最有希望的病毒载体。然而，它们的大规模生产仍然是开发这一类型疗法的限制因素。因此，为了克服这一难题并出于生物安全的原因，已开发了利用杆状病毒感染昆虫细胞的能力的生产系统（Urabe等，2002，Hum.Gene Ther.13:1935-1943；US20030148506；US20040197895）。根据最初提出的方案，为了提供rep和cap辅助基因和包含含有形成重组病毒粒子所需的转基因的重组AAV载体的构建物，需要用3种不同的杆状病毒感染昆虫细胞。这一系统的简化形式由将rep和cap基因整合到单种杆状病毒中构成，产生使用2种杆状病毒的生产系统（rep/cap bac和转基因-bac）（Smith等，2009，Mol.Ther.17:1888-1896）。此外，Sergei Zolotukhin的研究组（Aslanidi等，2009，Proc.Natl.Acad.Sci.USA206:5059-5064和WO2010/114948）最近开发了用rep和cap基因稳定转化的Sf9细胞系。使用这样的细胞系，单种杆状病毒（在其基因组中包含侧翼带有AAV的ITR的治疗性目的基因）的感染将使获得重组AAV成为可能。然而，这种系统具有几个缺点。首先，细胞克隆的产生要求苛刻，并且获得的克隆通常表现出遗传不稳定的特征，导致可利用的时间窗口受限。另外，已观察到不对应于目的载体的外来DNA（rep和cap以及抗生素抗性基因的序列）的高频率包装，从而在生物安全性方面产生相当大的问题。因此，这样的克隆不适合于批量生产用于临床应用目的的载体。

在上面提到的研究中使用的所有杆状病毒都包含插入到杆状病毒基因组的多角体蛋白克隆位点中的目的基因（不论它是rep和/或cap基因还是治疗性目的基因）。通常选择这一位点的原因是可以从这个基因座获得高的表达水平。在由Luckow等开发的系统（1993，J.Virol.67:4566–4579）中也使用这一位点，在所述系统中插入了细菌复制原点、卡那霉素抗性基因和“Tn7”重组克隆位点。这种系统被称为杆粒。然而，这种单一基因座的使用构成了限制因素，特别是如果希望能够从单种杆状病毒表达几种异源序列的话。正是在这种情况下，Noad等（2009）将常规基因座——多角体蛋白（杆粒的Tn7，存在于多角体蛋白位点处）——与几种潜在的克隆位点进行比较，并在AcMNPV基因组中鉴定到允许异源基因强烈表达的其他7个基因座（ctx、egt、39k、orf51、pg37、iap2、odv-e56）（Noad等，2009，BMCMolecular Biology10:87；WO2010/055292）。还已显示，在这些基因座的几个中克隆的各个基因可以从同一基因组同时表达。然而，Noad等没有显示这些可选替的基因座是否对重组AAV或任何其他重组病毒载体的生产有效，由于这些病毒载体的复杂性及其生产期间通常遇到的重要困难，这一点并不是显而易见的。

发明概述

令人吃惊的是，本发明可以显示能够利用单种杆状病毒来生产重组AAV。

因此，本发明涉及一种重组杆状病毒基因组，其包含编码生产异源病毒载体所需的所有组分（即载体的蛋白质组分及其基因组）的异源序列，所述异源序列插入到基因座中，所述基因座选自可以被目的序列替换而不改变杆状病毒功能的杆状病毒非必需基因。

具体来说，本发明涉及一种重组杆状病毒基因组，其包含一个或多个用于异源病毒载体生产所需的蛋白质组分的表达盒，以及异源病毒载体的重组基因组（在后文中也称为异源基因组），所述表达盒和所述异源基因组被插入到选自egt、多角体蛋白、ctx、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56、p10和p94基因座的一个或多个基因座中。具体来说，所述杆状病毒基因组可以包含插入到所述一个或多个基因座中的至少一个用于AAV rep和/或cap基因的表达盒。根据一种变化形式，所述rep和cap基因尤其是采取反向取向，被包含在单种表达盒中，更具体来说所述表达盒被插入到egt基因座中。在一种特定实施方式中，所述异源病毒载体的重组基因组是AAV重组基因组，其插入到与用于AAV rep和cap基因的一个或多个基因座不同的基因座中，具体来说所述异源基因组在所述多角体蛋白基因座的水平上插入。