[发明专利]聚合酶组合物、制备和使用所述聚合酶组合物的方法

权利要求书

1.一种用于进行核苷酸聚合反应的方法，包括：

在一个或多个核苷酸存在的情况下，在高离子强度溶液存在的情况下，将修饰的聚合酶或其生物活性片段与核酸模板接触，其中所述修饰的聚合酶或其生物活性片段相对于参照聚合酶包括一个或多个氨基酸修饰并且相对于参照聚合酶具有增加的解离时间常数；和

使用修饰的聚合酶或其生物活性片段聚合所述一个或多个核苷酸的至少一个。

2.权利要求1的方法，其中所述聚合还包括以模板依赖性方式聚合至少一个核苷酸。

3.权利要求1的方法，还包括在接触之前、期间或之后将引物与核酸模板杂交，并且其中所述聚合包括使用修饰的聚合酶或其生物活性片段将至少一个核苷酸聚合至引物的末端。

4.权利要求1的方法，其中在能够检测至少一个核苷酸被所述修饰的聚合酶或其生物活性片段聚合的传感器附近进行所述聚合。

5.权利要求1的方法，还包括使用传感器检测表明一个或多个核苷酸的至少一个被所述修饰的聚合酶或其生物活性片段聚合的信号。

6.权利要求5的方法，其中所述传感器是ISFET。

7.权利要求1的方法，其中所述高离子强度溶液含有约200mM至约300mM的盐。

8.权利要求7的方法，其中所述盐包括NaCl和/或KCl。

9.权利要求1的方法，其中所述修饰的聚合酶或其生物活性片段包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24具有至少90%的同一性的至少100个氨基酸残基。

10.一种用于进行核酸扩增的方法，包括：

产生具有修饰的聚合酶或其生物活性片段、引物、核酸模板以及一个或多个核苷酸的扩增反应混合物，其中所述修饰的聚合酶或其生物活性片段相对于参照聚合酶包括一个或多个氨基酸修饰并且相对于参照聚合酶具有增加的解离时间常数；和

将扩增反应混合物经历扩增条件，其中使用所述修饰的聚合酶或其生物活性片段将所述一个或多个核苷酸的至少一个聚合至引物的末端，并且其中所述扩增条件包括高离子强度溶液的存在。

11.权利要求10的方法，其中所述高离子强度溶液包含约200mM至约300mM NaCl或KCl。

12.权利要求10的方法，其中所述扩增条件包括通过聚合酶链式反应、乳液聚合酶链式反应、等温扩增、重组聚合酶扩增或链置换扩增扩增核酸模板。

13.一种检测核苷酸掺入的方法，包括：

在高离子强度溶液存在的情况下使用修饰的聚合酶或其生物活性片段、核酸模板和一个或多个核苷三磷酸进行核苷酸掺入；从而产生核苷酸掺入的一种或多种副产品；和

检测核苷酸掺入的一种或多种副产品的至少一种的存在，从而检测核苷酸掺入。

14.权利要求13的方法，其中所述检测包括测定核苷酸掺入的身份。

15.权利要求13的方法，其中核苷酸掺入的副产品是氢离子。

16.权利要求15的方法，其中所述离子是氢离子。

17.一种用于进行核酸测序的方法，包括：

在一个或多个核苷酸存在的情况下，在高离子强度溶液存在的情况下，将修饰的聚合酶或其生物活性片段与核酸模板接触，其中所述修饰的聚合酶或其生物活性片段相对于参照聚合酶包括一个或多个氨基酸修饰，并且其中所述修饰的聚合酶或其生物活性片段相对于参照聚合酶具有增加的解离时间常数；和

使用所述修饰的聚合酶或其生物活性片段聚合一个或多个核苷酸的至少一个。

18.权利要求17的方法，其中所述一个或多个核苷酸不包含可检测标记物。

19.权利要求17的方法，其中所述修饰的聚合酶具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO.24的至少95%的同一性。

20.权利要求17的方法，其中所述方法还包括测定被修饰的聚合酶聚合的一个或多个核苷酸的身份。