[发明专利]从混合物中分离感兴趣的寡核苷酸的方法

说明书

本发明涉及新方法，特别是使用无载体液-液色谱法分离寡核苷酸和化学杂质的方法。

寡核苷酸包含相对短序列的核酸聚合物，其可为DNA或RNA，典型具有50个或更少的碱基，虽然现在可合成具有多至约200个碱基的寡核苷酸。寡核苷酸有用于治疗。被Prosensa公司以其名称PRO051和本申请名称GSK2402968确定的一种合成的RNA寡核苷酸具有序列5’-uca agg aag aug gca uuu ca-3’。此寡核苷酸是一种反义寡核苷酸，即与所选序列互补的DNA或RNA单链。认为其诱导外显子(exon)51的外显子遗漏，且在用于治疗具有杜氏肌肉营养不良(DMD)的非卧床男孩的III期临床研究中。

此类寡核苷酸的一个问题是其从杂质的纯化。例如上述GSK2402968是20-mer，且在其合成中其可受到杂质污染，包括含有更短链或更长链，例如含有17、18、19和21个碱基的其它寡核苷酸。还可能存在其它杂质。

希望提供有效并可应用于工业生产规模的用于分离此类寡核苷酸的方法。“Therapeutic oligonucleotides:The state of the art in purification technologies”，Sanghvi等人，Current Opinion in Drug Discovery(2004)Vol.7No.8综述了用于寡核苷酸纯化的方法。该文献公开了其它方法。已使用各种方法用于纯化DNA和RNA序列。WO-A-01/55160公开了通过与污染物形成亚胺键然后采用色谱法或其它技术除去亚胺连接的杂质以纯化寡核苷酸。“Size Fractionation of DNA Fragments Ranging from20to30000Base Pairs by Liquid/Liquid chromatography”，Muller等人，Eur.J.Biochem(1982)128-238公开了使用其上已沉积了PEG/右旋糖酐相的微晶纤维素实体柱用于分离核苷酸序列。“Separation and identification of oligonucleotides by hydrophilic interaction chromatography”，Easter等人，The Analyst(2010)，135(10)公开了使用改进的HPLC利用固体二氧化硅载体相分离寡核苷酸。“Fractionation of oligonucleotides of yeast soluble ribonucleic acids by countercurrent distribution”，Doctor等人，Biochemistry(1965)4(1)49-54公开了使用包装干DEAE-纤维素的干实体柱。“Oligonucleotide composition of a yeast lysine transfer ribonucleic acid”，Madison等人，Biochemistry，1974，13(3)公开了使用固相色谱法用于分离核苷酸序列。维基百科在以下网址公开了使用亲水作用色谱，使用固体二氧化硅基质用于分离生物分子：http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrophilic_interaction_chromatography。

液-液色谱法是已知的分离方法。液-液色谱法使用双相性液体系统，该系统包含维持在伸长柱中的固定液相(类似于常规色谱中配置在管柱中的固相)，以及使之与固定相接触流经该柱的流动液相。在此流动中，物质将以类似于常规固相色谱的方式在流动相和固定相之间分配。在液-液色谱技术中流动相将物质洗脱分离为类似于常规液-固相色谱的不同级分。在液-液色谱中该方法通常无载体操作，即无需固体载体基质承载该液相，其依靠旋转柱内的离心力在该过程中维持它们的彼此接触关系。“Countercurrent Chromatography-The Support-Free Liquid Stationary Phase”，Billardello，B.，Berthod，A；Wilson&Wilson’s Comprehensive Analytical Chemistry38，Berthod，A.，编辑；Elsevier Science B.V.:Amsterdam(2002)pp177-200提供了有用的液-液色谱法的一般说明。

已知各种液-液色谱技术。