[发明专利]蛋白质表达

说明书

本发明涉及经遗传修饰的酵母细胞，其能够过表达至少一种支持所述细胞内多肽或蛋白质的生物合成的多肽或蛋白质。

分子伴侣(chaperone)，特别是蛋白质二硫化物异构酶(PDI)，是特别存在于真核生物内质网中的众所周知的酶。分子伴侣协助细胞内大分子结构如蛋白质和多肽的折叠或解折叠和装配或解体。例如，PDI能催化蛋白质和多肽内半胱氨酸残基之间的二硫键的形成、破裂和重排。PDI在蛋白质表达中起着至关重要的作用，因为该酶负责在真核细胞中表达的含二硫键蛋白质的正确折叠。许多在重组蛋白质表达中常规使用的原核生物，包括大肠杆菌(E.coli)，缺少PDI活性。

为了表达正确折叠的包含二硫键的多肽和蛋白质，本领域中提出在紧接感兴趣的多肽或蛋白质处还表达PDI。PDI在重组宿主细胞中的共表达不仅产生正确折叠的产物，而且还负责比不表达PDI或以比共表达PDI的那些细胞表达更低量PDI的细胞更高的产物产率(参见例如WO94/08012)。而且，发现天然表达PDI的真核细胞中增加的PDI形成导致显著增加的感兴趣蛋白质或多肽的生物合成，尽管存在如Butz JA等(Biotech Bioeng84(2003):292-304)中报告的例外。

在WO93/25676中，提出将包含编码PDI的基因的重组表达盒整合到宿主细胞，特别是酵母细胞的基因组中。例如，这类表达盒到酵母细胞基因组中的整合不是价值不高的。在整合方法的过程中，高度可能的是表达盒整合到基因组中超过一次且可能在不同位点。因此，生成具有相同特性的酵母细胞并非总是可能的。此外，本领域中还已知整合到酵母细胞基因组中的核酸分子的表达效率高度依赖于整合位点。这意味着表达盒在细胞内一个基因座处的整合相比于其中表达盒整合到基因组内另一个位点处的细胞将最可能产生不同的结果。包含这类重组PDI表达盒的酵母细胞仍然产生其编码基因可天然见于细胞内的PDI。因此，这类细胞在一方面从表达盒表达PDI，另一方面表达天然存在于细胞基因中的PDI。这可能导致培养方法过程中细胞内的不同PDI水平。而且，靶蛋白的生成可能由于对转录或翻译的代谢性竞争受到从重组表达盒过表达PDI的负面影响(Butz JA等,Biotech Bioeng84(2003):292-304)。

使用如WO93/25676中提出的重组表达盒的一个别的和重要的缺点是需要用至少两种核酸构建体来共转化酵母细胞，一种携带编码PDI的基因，而另一种包含编码要在宿主细胞内表达的感兴趣的至少一种蛋白质的至少一个基因(Gupta CS等,J Mol Endocrin22(1999):273-283)。共转化需要提供一次性提供至少两种不同的选择标志，这在实际中经常导致克隆选择过程中的假阳性克隆问题。或者，可能需要系列转化策略，使用分开转化例如携带编码PDI的基因的核酸构建体的第一次转化，和携带编码要在宿主细胞内表达的感兴趣的至少一种蛋白质的至少一个基因的核酸构建体的第二次转化(Payne MS等,Gene194(1997):179-182)。因此，倾向于有克隆变异。转化携带编码PDI的基因以及要在宿主细胞内表达的感兴趣的至少一种蛋白质的至少一个基因两者的一种核酸构建体在实际中产生低转化效率的限制，这是因为该核酸构建体的大分子量。此外，潜在的质粒不稳定性，不管在整合还是染色体外形式中，均产生困难(Finnis CJA等,Microbial Cell Factories9(2010):87)。

Subramanian等(PNAS103(2006):939-944)报告替换pbn1基因的启动子来研究缺少转录和因此由该基因编码的蛋白质的可获性的后果。作者发现Pbn1p是降解内质网中的内腔蛋白质所需要的。

本发明的一个目的是提供允许以比本领域中已知方法高得多的产率来合成感兴趣多肽或蛋白质的手段和方法。

因此，本发明涉及用于生成感兴趣的重组蛋白质或多肽的方法，包括以下步骤：

-提供经遗传修饰的酵母细胞，其包含：

a)分泌盒，其包含编码感兴趣蛋白质或多肽的重组核酸分子，和

b)至少一个重组启动子可操作地连接于编码多肽或蛋白质的至少一个基因，所述多肽或蛋白质支持所述细胞内多肽或蛋白质的生物合成，所述至少一个基因位于未经遗传修饰的野生型酵母细胞的天然基因组基因座，其中所述编码生物合成支持性多肽或蛋白质的至少一个基因的天然存在的启动子通过在所述天然存在的启动子内的至少一个突变而失活，