[发明专利]JAK2的突变分析

权利要求书

1.检测在具有至少第一突变体和野生型等位基因的JAK2基因中的基因座不存在野生型等位基因的方法，所述方法包括：

a)提供反应混合物，其包含：

i)样品，所述样品包含代表JAK2基因的至少一部分的核酸；

ii)寡核苷酸探针，其与突变体等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与野生型等位基因杂交的解链温度；

iii)用于核酸扩增的成对寡核苷酸引物，所述引物与所述样品中的所述核酸在寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点杂交；其中引物：样品的Tm高于探针：突变体等位基因的Tm；

b)保持所述反应混合物在所述探针：突变体等位基因的Tm与所述探针：野生型等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与所述野生型等位基因杂交；

c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸阶段和退火阶段的温度在所述探针：突变体等位基因的Tm与所述探针：野生型等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与所述野生型等位基因杂交；由此扩增所述突变体等位基因；和

d)在等于或低于所述探针：突变体等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在等于或低于所述探针：野生型等位基因的Tm的更高的温度检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所述野生型等位基因的存在或不存在。

2.权利要求1的方法，其中在步骤a)i)中由所述样品代表的JAK2基因的部分跨越SEQ ID NO4所示的JAK2基因的nt2343。

3.权利要求2的方法，其中所述突变体等位基因是在nt2343的突变。

4.权利要求3的方法，其中所述突变体形式是T2343，而所述野生型是G2343。

5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述探针被设计为跨越nt2343和足够的另外的核苷酸，以能够检测在氨基酸残基618的突变。

6.权利要求2-5中任一项的方法，其中所述探针跨越nt2343。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针长度优选为至少15、20、25、26、27、28、29、30个核苷酸。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针包含序列TTTAAATTATGGAGTATG TGT CTG TGGAGA(SEQ ID NO：1)，或由序列TTT AAA TTA TGG AGT ATG TGT CTG TGG AGA(SEQ ID NO：1)组成。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述引物扩增JAK2序列的一部分，其长度为至少50、60、70、80、90、100个核苷酸。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一个所述引物包含核苷酸序列TCT TTGAAG CAG CAAGTATGATGA(SEQ ID NO2；正义引物)或GCA TTA GAA AGC CTG TAG TTT TAC TT(SEQ ID NO3，反义引物)，或由核苷酸序列TCT TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA(SEQ ID NO2；正义引物)或GCATTA GAAAGC CTG TAG TTT TAC TT(SEQ ID NO3，反义引物)组成。

11.权利要求10的方法，其中所述引物由核苷酸序列TCT TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA(SEQ ID NO2；正义引物)和GCA TTA GAA AGC CTG TAG TTT TAC TT(SEQ ID NO3，反义引物)组成。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述探针是被标记的。

13.权利要求12的方法，其中所述标记根据所述探针已经与靶标链杂交(即，所述探针是双链核酸的一部分)还是未与之杂交(所述探针是单链的)产生不同的信号。

14.寡核苷酸探针，其包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成。

15.引物序列，其由SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列。