[发明专利]3-羟基异丁酸的生物技术制备

权利要求书

1.方法，其包括以下步骤：

a) 提供异丁酸，

b) 使异丁酸与

异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或

异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或

异丁酸辅酶A转移酶的组合，

c) 使步骤b）的产物与异丁酰辅酶A脱氢酶接触，

d) 使步骤c）的产物与甲基丙烯酰辅酶A水合酶接触，和

e) 水解步骤d）的产物以形成3-羟基异丁酸，

其中以细胞的形式提供至少一种在步骤b）、c）和d）中使用的选自异丁酸激酶、磷酸转异丁酰酶、异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和异丁酸辅酶A转移酶的酶，优选地所有的酶均以细胞的形式提供，所述酶具有相比于它的野生型降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性。

2.权利要求1的方法，其中通过使异丁烷与单加氧酶，优选烷羟化酶，更优选AlkBGT型或其变体的一种接触来形成异丁酸。

3.权利要求1-2中任一项的方法，其中步骤d）中所述的水解通过使步骤d）的产物与3-羟基异丁酰辅酶A水解酶接触来实现。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细胞具有步骤c）中的异丁酰辅酶A脱氢酶和步骤d）中的甲基丙烯酰辅酶A水合酶，和

异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或

异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或

异丁酸辅酶A转移酶的组合。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞另外具有烷羟化酶，优选AlkBGT型或其变体中的一种。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述3-羟基异丁酸脱氢酶是XP_504911.1或其变体。

7.细胞，其具有至少一种选自异丁酰辅酶A合成酶/连接酶、异丁酸辅酶A转移酶、异丁酸激酶、磷酸转异丁酰酶、异丁酰辅酶A脱氢酶和甲基丙烯酰辅酶A水合酶的酶，和相比于它的野生型，降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性。

8.权利要求7的细胞，其中除了异丁酰辅酶A脱氢酶和除了甲基丙烯酰辅酶A水合酶之外，所述细胞具有

异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或

异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或

异丁酸辅酶A转移酶的组合，

优选还有3-羟基异丁酰辅酶A水解酶。

9.权利要求7-8中任一项的细胞，其进一步包含烷羟化酶，优选AlkBGT型或其变体中的一种。

10.权利要求6-8中任一项的细胞，其中所述3-羟基异丁酸脱氢酶是XP_504911.1或其变体。

11.权利要求7-10中任一项的细胞用于制备3-羟基异丁酸的用途。

12.权利要求11的用途，其中所述3-羟基异丁酸脱氢酶是XP_504911.1或其变体。

13.权利要求1-6中任一项的方法，权利要求7-10中任一项的细胞或权利要求11-12中任一项的用途，其中所述细胞是细菌细胞或低等真核细胞。

14.权利要求1-5或13中任一项的方法，权利要求7-10或13中任一项的细胞或权利要求11-13中任一项的用途，其中涉及选自耶罗维亚酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、酵母属（Saccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）和毕赤酵母属（Pichia）的属的酵母细胞，并且优选涉及解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)。

15.反应混合物，其包含权利要求7-10或13-14中任一项的细胞以及异丁烷或异丁酸。