[发明专利]核酸扩增方法

说明书

提供一种核酸扩增方法及手段，其能够减少扩增模板DNA所需工夫和时间，同时解决目前扩增方法存在的问题，并提供一种利用上述核酸扩增方法及手段的碱基序列确定方法及手段。一种核酸扩增方法，其包含将包含能够形成折返结构的接头DNA链的双链接头(20)连接于包含靶DNA序列(1)的双链DNA(1)、(2)，调制由包含切口(5)的双链DNA构成的环状DNA模板的工序，以及在链置换型DNA聚合酶的作用下，以该切口(5)为起点进行3’末端延伸反应，从而形成形状为该靶DNA序列(1)和该能够形成折返结构的接头DNA链作为单链DNA而串联地连接多个的串联体(29)的工序，该串联体(29)包含最适合进行碱基序列解析的多个靶DNA序列(1)，并且具有通过该折返结构折叠成球状的形状。

技术领域

本发明涉及一种用于扩增靶DNA序列从而形成串联体(concatemer)的方法及试剂盒。此外，本发明涉及一种用于使用前述形成的串联体确定碱基序列的方法、试剂盒及装置。

背景技术

近年来，开发出了通过超并行碱基序列测定进行的快速且高灵敏度的碱基序列确定方法(非专利文献1)，随着使用该方法的装置的普及，在一周内对植物、真菌、动物、细菌及病毒的全基因组进行解析成为可能。如此得到的碱基序列信息是现今药品开发、医疗、农业各领域不可或缺的资源。毫无疑问，基因序列信息的应用领域在今后会进一步扩大。预计今后会要求进一步提高通量及精度。此外还认为如表达解析这种要求正确的定量性的领域也会不断成熟。

超并行碱基序列测定中，将数百万到数十亿个单克隆DNA片段簇配置于流路基板上，通过并行读取各个簇的核酸片段的碱基序列，实现了高通量。其中，作为形成多个簇并将其配置于流路基板上的手段，使用(a)在模板DNA的一端固定于流路基板上的状态下进行PCR、(b)将乳液PCR(emPCR)产物固定于固体珠、(c)通过环状DNA上的等温扩增形成DNA纳米球等方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第7910354号

专利文献2：日本特表2011-509095号公报(WO2009/089384)

专利文献3：美国专利第5712124号

专利文献4：美国专利第6235502号

专利文献5：美国专利申请公开第2009/0270273号

专利文献6：日本特开2011-58号公报

非专利文献

非专利文献1：J.Shendure and H.Ji，“Next-generation DNA sequencing”，Nature biotechnology第26卷第1135-1145页、2008年

非专利文献2：M.L.Metzker，“Sequencing technologies-the nextgeneration”，Nature Reviews Genatics第11卷第31-46页、2010年

发明内容

发明要解决的问题

超并行碱基序列测定对解析通量及精度的提高有较大贡献，但用于将多个簇配置于流路基板上所需的时间和工夫已成为谋求通量和精度的提高时的障碍。需要进行技术开发以进一步提高定量性。超并行碱基序列测定中，将多个聚集有单克隆DNA片段的簇配置于流路基板，并行读取各个簇的序列。非专利文献2公开了几个有关使簇形成于流路基板上的方法的例子。下面对此前所提出的具有代表性的簇形成法(a)～(c)进行探讨。