[发明专利]制备主要组织相容性复合物基因修饰小鼠的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求申请日为2011年10月28日的美国临时专利申请号61/552,582和61/552,587以及申请日为2012年9月14日的美国临时专利申请号61/700,908的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

技术领域

本发明涉及基因修饰的非人动物例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，其表达人源或人源化的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子。本发明还涉及基因修饰的非人动物，例如小鼠或大鼠，其表达人源或人源化的MHC I蛋白(例如MHC Iα链)和/或人源或人源化的β2微球蛋白；及表达人源或人源化的MHC I蛋白(例如MHC Iα链)和/或人源或人源化的β2微球蛋白的胚胎、组织和细胞。本发明进一步提供了一种制备基因修饰的非人动物的方法，所述动物表达人源或人源化的MHC I类蛋白(例如MHC Iα链)和/或β2微球蛋白。本发明还提供了一种在体外人源化细胞免疫系统或基因修饰的非人动物中鉴定和评估肽的方法，以及修饰非人动物例如小鼠或大鼠的MHC I和/或β2微球蛋白基因座以表达人源或人源化的MHC I和/或β2微球蛋白的方法。

背景技术

在适应性免疫应答中，通过B淋巴细胞(例如免疫球蛋白)和T淋巴细胞(例如T细胞受体或TCR)上的受体分子识别外来抗原。这些外来抗原在细胞表面上以特定蛋白的肽片段递呈，通常将其称为主要组织相容性复合物(MHC)分子。MHC分子由多个基因座编码，已发现其为跨距约4Mb的连锁的基因簇。在小鼠中，MHC基因位于17号染色体上，并且由于历史原因被称为组织相容性2(H-2)基因。在人中，该基因位于6号染色体上，被称为人白细胞抗原(HLA)基因。在小鼠和人中，所述基因座是多基因的，其包括三个在人和小鼠基因组中具有相似构造的高多态性类型的MHC基因(I、II和III类)(分别参见图2和图3)。

MHC基因座在基因组中显示出最高的多态性；一些基因通过＞300个等位基因代表(例如人HLA-DRβ和人HLA-B)。全部I类和II类MHC基因均能递呈为肽片段，但是各基因表达具有不同结合特性的蛋白，这反映了多态性和等位基因变体。在免疫应答过程中任何具有独特肽片段范围的给定个体均能够递呈被递呈至B和T细胞的细胞表面。

人与小鼠均具有I类MHC基因(参见图2和图3)。在人中，经典的I源基因被称为HLA-A、HLA-B和HLA-C，而在小鼠中被称为H-2K、H-2D和H-2L。I类分子由两条链组成：多态性的α-链(有时被称为重链)和被称为β2-微球蛋白的较小的链(也被称为轻链)，其通常不具有多态性(图1)。这两条链在细胞表面上形成非共价的异源二聚体。所述α-链包含三个结构域(α1、α2和α3)。α链基因的外显子1编码先导序列，外显子2和3编码α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜结构域，而外显子6和7编码胞质尾区。α-链形成含有α1和α2结构域的肽结合缝隙(类似于Ig-样结构域)接着为类似于β2-微球蛋白的α3结构域。

β2微球蛋白是一种非糖基化的12kDa蛋白；其功能之一在于稳定MHC I类α-链。与α-链不同，所述β2微球蛋白不跨膜。所述人源β2微球蛋白的基因座在15号染色体上，而鼠源的基因座在2号染色体上。β2微球蛋白的基因由4个外显子和3个内含子组成。循环形式的β2微球蛋白存在于血清、尿液和其他体液中；因此，非共价MHC I结合的β2微球蛋白在生理条件下能够与循环β2微球蛋白进行交换。

I类MHC分子在所有有核细胞中表达，包括肿瘤细胞。其特异性地在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞以及其他细胞上表达并且其功能为在CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面展示肽片段(长度通常为8-10个氨基酸)。CTL通过其自身的膜结合TCR特异性地杀伤携带MHC I结合肽的任意细胞。当细胞展示非正常存在的细胞蛋白来源的肽(例如病毒、肿瘤或其他非自身来源)时，这种肽被CTL所识别，CTL被激活并杀伤展示该肽的细胞。