[发明专利]用于定向核酸扩增和测序的组合物和方法

说明书

交叉引用

本申请要求2011年10月9日提交的美国临时申请号61/549,162的权益，该临时申请通过引用并入本文。

发明背景

高通量、新一代测序技术的最新进展已经使得全基因组测序和功能基因组学的新方法成为可能，包括对任意转录组的全面分析。这些新一代测序方法之一涉及对由信使和结构RNA产生的互补DNA(cDNA)的直接测序(RNA-Seq)。RNA-Seq提供了超越传统测序方法的几个关键优势。首先，其允许对所有表达的转录物进行高分辨率研究，从而注释出各转录物的5’和3’末端以及剪接点。其次，RNA-Seq允许对每个细胞中的转录物的相对数进行定量。第三，RNA-Seq提供了一种通过测量每种剪接变体的水平来测量和表征RNA剪接的途径。总之，这些进展已经提供了对个别细胞功能的新的了解。

进行标准RNA-Seq的一个缺点是缺乏有关转录方向的信息。为了RNA-Seq而构建的标准cDNA文库由随机引物双链cDNA组成。在测序之前含有通用引发位点的衔接子的非定向连接导致有关哪条链存在于原始RNA模板中的信息丢失。虽然在一些情况下可以通过后续分析，例如通过使用编码蛋白质的转录物中的开放阅读框(ORF)信息，或者通过评估真核基因组中的剪接位点信息来推测链信息，但是关于起源链的直接信息是非常符合期望的。例如，为了将有义链指定至非编码RNA，以及在解析重叠的转录物时，就需要有关在原始RNA样品中存在哪条链的直接信息。

最近已经针对链特异性RNA-Seq开发了几种方法。这些方法可分成两大类。第一类利用相对于RNA转录物的5’和3’末端处于已知方向的不同衔接子。最终结果是cDNA文库，其中原始RNA的5’和3’末端的侧翼为两个不同的衔接子。该方法的缺点是只有克隆分子的末端保留了方向信息。对于长克隆的链特异性操作而言，这可能会存在问题，并且当存在断裂(fragmentation)时可能导致方向信息的丢失。

第二类链特异性RNA-Seq方法标记原始RNA(例如，通过亚硫酸氢盐处理)或转录的cDNA(例如，通过修饰的核苷酸的掺入)的一条链，随后使未标记的链降解。通过亚硫酸氢盐处理对RNA的链标记是劳动密集的，并且需要将测序读取值(reads)与参照基因组进行比对，所述参照基因组的两条链之一上的所有胞嘧啶碱基已经转换为胸腺嘧啶。由于亚硫酸氢盐处理过程中的碱基转换效率是不完美的，即小于100％，使得该分析更加复杂。

通过对cDNA的第二链进行修饰的链标记已经成为定向cDNA克隆和测序的优选方法(Levin等人,2010)。然而，cDNA第二链标记方法，如在WO2011/003630中所述的方法，当使用采用双链体衔接子的常规平端连接和cDNA文库构建策略(其中由两个单独的衔接子引入两个通用测序位点)时，不足以保留方向性信息。WO2011/000360中所述的标记方法采用由以下步骤组成的四步过程：1)可裂解核苷酸向cDNA插入物的一条链中的掺入，2)cDNA插入物的末端修复，3)含有通用测序位点的衔接子的非定向连接，和4)具有非期望的衔接子方向的文库片段的选择性水解。为了保留方向性信息，该方法需要对选择进行扩增的链的5’和3’末端进行区别标记，例如，这可以通过定向(即极性特异性的)衔接子的连接或通过使用特化的叉状衔接子来实现，在该叉状衔接子中，双链多核苷酸的每一条链共价连接至两个不同的通用测序位点，在该链的每一端具有一个测序位点。当使用常规双链体衔接子时，WO2011/000360所述方法的应用不产生定向测序文库，因为标记的链，即已掺入可裂解核苷酸的链，在其5’和3’末端没有被区别标记。

对于从利用常规双链体衔接子构建的cDNA文库进行定向cDNA测序的改进方法存在需求。本文所述的发明满足了这一需求。

发明内容