[发明专利]用于改善发酵单胞菌属(Zymomonas)中的木糖利用率的PNP基因修饰

说明书

本专利申请要求2011年12月20日提交的美国临时申请61/577871的优先权，该临时申请全文以引用方式并入本文。

政府权利声明

本发明由美国政府支持，以资助号合约号DE-FC36-07GO17056受到能源部资助。政府拥有本发明中的某些权利。

技术领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地，发酵单胞菌属(Zymomonas)基因组中的pnp基因被鉴定为用于修饰的靶标，以提供改善的木糖利用率和乙醇的生产。

背景技术

通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。希望生产乙醇以及其它有用产品的微生物能够使用木糖作为碳源，因为木糖是水解的木质纤维素生物质中主要的戊糖。生物质能够提供丰富的可利用的低成本碳底物。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和其他天生不会利用木糖的产生乙醇的细菌已接受了遗传工程改造以利用木糖，上述遗传工程改造是通过引入编码下列的基因进行的：1)木糖异构酶，其催化木糖至木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶(US 5514583、US 5712133、US 6566107、WO 95/28476，Feldmann等人(1992)Appl.Microbiol.Biotechnol.，38：354-361，Zhang等人(1995)Science 267：240-243；Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)。通常所使用的编码区是来自大肠杆菌(E.coli)的基因。

即使有上述木糖利用途径的表达，经工程化改造的菌株通常在木糖上的生长和乙醇生产也不像在葡萄糖上那么好。通过连续传代，已使针对木糖的利用经工程化改造的菌株在木糖培养基上适应，产生了具有改善的木糖利用率的菌株，如美国专利7,223,575和美国专利7,741,119中所述。后者还公开了用以改善木糖利用率的编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的GFOR基因座的失活。美国专利7,998,722公开了通过从突变的高度活性的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(Pgap)表达大肠杆菌(E.coli)木糖异构酶，用于改善木糖利用率的工程化改造。

仍然存在对在包含木糖的培养基中具有改善的木糖利用率和乙醇生产的发酵单胞菌属(Zymomonas)和其他产乙醇细菌的工程化改造的菌株、以及使用这些菌株来生产乙醇的方法的需求。

发明内容

本发明提供了重组的利用木糖的发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属(Zymobacter)细胞，在其中编码多核苷酸磷酸化酶的内源性pnp基因是经修饰的。此外，所述细胞具有提高的核糖-5-磷酸异构酶(RPI)活性和非限制性的木糖异构酶活性。在这些细胞中，在包含木糖的培养基中的木糖利用率和乙醇生产是改善的。

因此，本发明提供了重组细菌宿主细胞，所述重组细菌宿主细胞包括：

a)木糖代谢途径，其包括至少一种具有木糖异构酶活性的多肽；

b)至少一种基因修饰，其与缺少所述基因修饰的宿主细胞中的核糖-5-磷酸异构酶活性相比，使所述宿主细胞中的核糖-5-磷酸异构酶活性升高；以及

c)编码多核苷酸磷酸化酶的内源性基因序列中的至少一种基因修饰，所述基因修饰使编码区缩短，导致C末端截短的蛋白质的表达；

其中所述细菌宿主细胞利用木糖以生产乙醇，木糖异构酶活性在所述细菌宿主细胞中不是限制性的。

在另一个实施例中本发明提供用于生产乙醇的方法，所述方法包括：

a)提供上文所述的重组宿主细胞；以及

b)在包含木糖的培养基中培养(a)的宿主细胞，从而使木糖被转化为乙醇。

附图说明和序列表

序列描述