[发明专利]用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途

权利要求书

1.一种选择分泌双特异性抗体的细胞的方法，包括步骤

(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含编码分泌型双特异性抗体的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71-IRES上游的穴基因座或结基因座中编码第一重链可变域的核酸、和在EV71-IRES下游的相应另一个基因座中编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，其中真核细胞表达共同轻链，和

(b)根据分泌型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。

2.根据权利要求1的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞展示或分泌单一全长双特异性抗体。

3.根据权利要求1的方法，特征在于，包括以下一个或多个步骤作为第一步骤：

-用目的抗原免疫转基因动物，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，和/或

-通过FACS通过大批分选，选择免疫的实验动物的B细胞，和/或

-通过分开PCR扩增，获得每个B-细胞的重链编码核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单一限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体。

4.根据权利要求2的方法，特征在于，包括以下一个或多个步骤作为第一步骤：

-用目的抗原免疫转基因动物，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，和/或

-通过FACS通过大批分选，选择免疫的实验动物的B细胞，和/或

-通过分开PCR扩增，获得每个B-细胞的重链编码核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单一限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体。

5.根据权利要求2至4中任一项的方法，特征在于包括步骤：

-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸，克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体，任选地如果存在第一重链的跨膜结构域，通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域。

6.根据权利要求2至4中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含

-启动子，

-编码第一全长抗体重链的第一核酸，

-任选地，编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸，

-EV71-IRES，

-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和

-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。

7.根据权利要求1的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含

-启动子，

-编码第一全长抗体重链的第一核酸，

-EV71-IRES，

-编码第二全长抗体重链的第二核酸。

8.根据权利要求1-4和7中任一项的方法，特征在于抗体是双价双特异性抗体。

9.根据权利要求1-4和7中任一项的方法，特征在于抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。

10.根据权利要求1-4和7中任一项的方法，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。

11.根据权利要求1-4和7中任一项的方法，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。

12.根据权利要求1-4和7中任一项的方法，特征在于全长抗体包含人源恒定区。

13.根据权利要求12的方法，特征在于全长抗体包含人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。

14.根据权利要求1-4和7中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。

15.根据权利要求14的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。

16.根据权利要求1-4和7中任一项的方法，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的其它全部内含子。