[发明专利]重组固氮细菌菌株、含有所述菌株的接种物以及应用方法

说明书

本申请涉及重组固氮(nitrogen-fixing)细菌菌株、含有所述菌株的接种物(inoculum)和应用方法。更具体地，其涉及包含异源nif基因并且能够固氮的重组细菌菌株。

背景技术

已经描述了两种旨在改进在氮缺乏土壤中生长之植物的生产力的处理/技术：(a)用含氮化合物(例如尿素)施肥以及(b)用固氮细菌接种。存在两种类型的固氮细菌：(b1)共生细菌，其与豆科植物联合固氮(例如根瘤菌属(Rhizobium sp.)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.))和(b2)独立生存的固氮细菌(例如巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii))。使用第一种类型成功地改进了在氮贫乏的土壤中生长之农作物的生产力，但其仅适用于豆科植物。第二种类型可以用于所有类型的植物(不仅针对豆科植物)。然而，还没有表明由这些细菌固定的氮足以克服在氮贫乏的土壤中生长之植物所遭受的氮缺乏。尽管这样，目前在接种物的制备中使用例如巴西固氮螺菌(A.brasilense)和棕色固氮菌(A.vinelandii)的种，因为这样的细菌产生能够刺激根发育的植物激素。这是农学上重要的特性，但其与这些细菌的固氮能力没有关系。

专利申请EP0108508描述了用固氮相关基因修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株。然而，该大肠杆菌(E.coli)菌株不用于改进在氮贫乏的土壤中生长之植物的生产力，而是为了将固氮能力转移到其他微生物(例如大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum))。

发明概述

本发明的一个主题是提供细菌菌株，例如包含nif基因的重组荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。这样的菌株将能够固氮并且已经用黏粒X940转化。在一个优选的实施方案中，重组菌株包含PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因；PST_1307至PST_1312基因已经被缺失或替换，已经插入了来自质粒pUC4K(X06404)的卡那霉素抗性基因。对PST基因的描述可参见下列网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000304.1和http：//www.biomedcentral.com/1471-2164/11/11。在一个优选的实施方案中，重组荧光假单胞菌菌株包含PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因以及卡那霉素抗性基因。对于从业人员(expert)而言明显的是，在所提供的实例的基础上，任何人可通过使用本文所述的微生物转化和构建技术从不固氮的菌株获得不同的固氮细菌菌株和种。因此，用异源nif基因转化的形成固氮能力的任何细菌菌株或种落入本发明的范围内。nif基因可以是任何已知和公开的那些，例如在下列网址上公开的PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000304.1和http：//www.biomedcentral.com/1471-2164/11/11。基于可从本申请学到的，可将这样的基因引入不固氮的细菌并且将它们转化成固氮细菌，此外这高效地改进植物生产力。

本发明的另一个主题是提供旨在改进植物生产力的接种物，其包含重组细菌(例如荧光假单胞菌)，伴随这种菌株包含异源nif基因和载剂。所述接种物可以包含8.10⁸-2.10⁹个细胞/ml。基于从所提供的实例可得知的，从业人员可通过使用本发明的重组细菌制备不同的接种物，所有所述接种物落入本发明的范围内。