[发明专利]用于生产腺伴随病毒的细胞系

说明书

相关申请

本申请要求于2011年10月28日提交的美国临时申请号61/552,492的权益。本申请的完整内容全部通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及在无动物组分的悬浮条件下生长的HEK293细胞系。该细胞系对于腺伴随病毒（AAV）的快速和可扩大生产是理想的，并且支持所有AAV血清型和嵌合体的生产。

发明背景

重组腺伴随病毒（rAAV）载体已证实在体内具有很少毒性和炎症至无毒性和炎症的转导和长期基因表达。AAV的这些独特特征已导致其公认为用于基因治疗应用的主导载体候选物。许多利用AAV的I期和II期临床试验已在全世界执行（Aucoin等人，Biotechnol. Adv. 26:73（2008）；Mueller等人，Gene Ther. 15:858（2008））。然而，许多临床前研究和成功的临床试验已证实仍需要解决以支持rAAV的人基因治疗使用的许多挑战（Mueller等人，Gene Ther. 15:858（2008））。一个主要挑战是依照现代优良生产实践（cGMP）建立大规模制造技术，以获得扩展的临床需要所需的纯化载体数量。生成可扩大生产技术的成功在很大程度上依赖理解AAV关于生成试剂的基础生物学，例如细胞系、质粒或重组病毒载体等，当一起使用时，其将密切模拟野生型AAV生产。

AAV已分类为细小病毒科中的依赖病毒属，因为它需要与辅助病毒例如腺病毒（Ad）或单纯疱疹病毒（HSV）一起共感染用于细胞培养中的生产性感染(productive infection)（Atchison等人，Science 149:754（1965）；Buller等人，J. Virol. 40:241（1981））。细小病毒在最小的DNA动物病毒中，具有完全由蛋白质和DNA构成的直径大约25 nm的病毒粒子。AAV基因组是含有4679个碱基的线性、直链DNA分子（Srivastava等人，J. Virol. 45:555（1983））。野生型（wt）AAV基因组由两个基因构成，所述两个基因分别编码四种复制蛋白质和三种衣壳蛋白质，并且在任一端上侧翼为反向末端重复（ITR）（Lusby等人，J. Virol. 4:402（1980）；Srivastava等人，J. Virol. 45:555（1983））。ITR是基因组复制和包装到衣壳内所需的唯一顺式作用元件。四种复制蛋白质（Rep 78、68、52和40）是多功能的，并且在受感染细胞的核内的转录、病毒DNA复制和DNA包装到预形成的病毒衣壳内起作用（Chejanovsky等人，Virology 173:120（1989）；King等人，EMBO J. 20:3282（2001））。病毒衣壳由分别以1:1:8比的三种蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成。衣壳蛋白质由相同可读框（ORF）产生，但利用不同的翻译起始位点。