[发明专利]以生物钟为指标的低品质ES细胞和iPS细胞简单判别方法的开发，和以生物钟为指标的细胞评价方法的开发

说明书

技术领域

本发明涉及以生物钟作为指标，评价多能干细胞的方法和试剂盒。

背景技术

使用ES细胞或iPS细胞提供再生医学的最大问题，是从移植的细胞衍生的疾病如癌症的发作，其最大的原因据称是未分化细胞的污染。另外，一些由ES细胞或iPS细胞的低品质引起的问题也被指出。因而，在通过使用细胞移植实现再生医学中，ES细胞和iPS细胞的品质控制非常重要。因此，日本和海外的研究者已经开发了各种方法并一直在致力于建立iPS细胞的品质评价标准。

非专利文献1公开了ES细胞和iPS细胞不具有生物钟，并且生物钟由试管内分化诱导形成。然而，文中不包含关于ES细胞或iPS细胞的品质评价的数据。

在先技术文献

非专利文献

非专利文献1：K.Yagita等，美国国家科学院院刊(Proc.NATL.AcadSci.USA)，2010年2月23日；107(8)3846-3851。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的是提供用于评价多能干细胞的方法和试剂盒。

解决问题的手段

地球上大多数活生物体具有约24小时周期的生物钟(即昼夜节律钟)以便知道每天的时间。哺乳动物在几乎其整个身体的细胞中具有生物钟，并且它是参与细胞功能的控制。在以往的研究中，发明人发现，多能干细胞(“多功能细胞”)诸如ES细胞和iPS细胞没有生物钟，并且当这些细胞进行分化时发育生物钟。

当基于上述发现研究细胞分化过程中生物钟的发育机理时，本发明人发现，生物钟在具有异常表达诸如癌症基因的多能干细胞(例如ES细胞)中不正常发育，即使细胞是分化的。本发明人认为，通过使用该性质并检查用于再生医学的多能干细胞如iPS细胞或ES细胞由于细胞分化而发育生物钟的能力，将可以排除不能发育至少体细胞具有的生物钟的细胞。发明人从而确定了这样一种方法的建立。

在这种情况下，本发明人开发了通过使用生物钟作为指标，用于简单和定量地评价包括iPS细胞和ES细胞的多能干细胞的品质的方法。

本发明提供用于评价的下列方法和试剂盒。

项目1.用于评价多能干细胞的方法，所述方法包括：分析从多能干细胞分化的细胞中时钟基因的表达；和基于所述表达程度评价所述多能干细胞。

项目2.根据项目1的方法，其中所述时钟基因是Per2和/或Bmal1和/或Dbp。

项目3.根据项目1的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。

项目4.根据项目1的方法，所述方法还包括将基因构建体引入到要评价的多能干细胞中，所述基因构建体包括连接到所述时钟基因的启动子的报告基因，其中所述分析包括基于所述报告基因的表达分析时钟基因的表达模式。

项目5.根据项目4的方法，其中所述报告基因是荧光蛋白基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因或氯霉素乙酰转移酶基因。

项目6.一种用于评价包含基因构建体的多能干细胞的试剂盒，所述基因构建体包括连接到时钟基因的启动子的报告基因。

项目7.根据项目6的试剂盒，其中所述时钟基因是Per2和/或Bmal1和/或Dbp。

项目8.根据项目6的试剂盒，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。

项目9.根据项目6的试剂盒，其中所述报告基因是荧光蛋白基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因或氯霉素乙酰转移酶基因。

发明的效果

根据本发明，由于生物钟在具有异常表达诸如癌症基因的多能性干细胞中不正常发育，所以这样的多能干细胞可以从正常的多能干细胞排除。因而，没有成癌风险的多能干细胞的早期选择和使用已成为可能。虽然已经使用多能干细胞进行了多种研究，但是期望通过选择没有成癌风险的多能干细胞进行更适当的研究。

根据本发明，通过检查由于再生医学中使用的多能干细胞诸如iPS细胞和EP细胞的细胞分化而发育生物钟的能力，可以排除不能发育至少体细胞具有的生物时钟的细胞。因而，建立了简单且定量的评价包括iPS细胞和ES细胞的多能干细胞的品质的方法。

附图说明

图1：图1显示当根据本发明的方法诱导正常小鼠ES细胞(高品质iPS细胞的模型)分化时，出现的生物时钟振荡。

图2：图2显示当根据本发明的方法诱导特征在于癌基因c-Myc(低品质ES/iPS细胞的模型)的弱表达的ES细胞分化时，出现的生物钟振荡，并显示用快速傅立叶变换的频率分析。