[发明专利]用于产生具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法及使用所述方法产生的植物

说明书

技术领域

本发明涉及基于对芥子醇的显著酶特异性的具有优异的丁香苷合成活性的重组糖基转移酶UGT72E3/2基因，基于用参与类苯基丙烷生物合成途径的F5H、HCT和CHS基因和作为用于正调节参与木质素生物合成途径的基因的转录因子的Myb58基因的代谢工程，用于产生具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法，以及涉及通过该方法获得的植物。

背景技术

从通过类苯基丙烷合成途径产生的作为构成木质素的组分的芥子醇(s型木质素单体(monolignol))中，通过糖基转移酶(UDP-葡萄糖转移酶)产生作为s型木质素单体糖苷的丁香苷。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有约100种糖基转移酶，已报道，其通过形成包括植物激素和次级代谢产物的多种化合物的糖苷，调节细胞活性和这些化合物在液泡中的储存。它们之中，报道过UGT72E2和UGT72E3作为糖基转移酶负责首先将木质素单体如松柏醇和芥子醇特异性地转化为木质素单体糖苷。特别是，作为生成丁香苷所需的芥子醇特异性糖基转移酶，UGT72E3对芥子醇具有很好的底物特异性，但其糖基转移酶活性很低，使其应用受到很大限制。因此，在丁香苷(其是药学上功能性次级代谢产物)大量生产和应用前，发展有利于在植物中有效生成丁香苷的新的糖基转移酶仍然是首要解决的问题。

此外，为了通过类苯基丙烷合成途径在植物中有效生成丁香苷,还需要具有使作为以微量存在于植物细胞中的丁香苷前体的芥子醇的含量增加的代谢工程技术，以及对芥子醇具有底物特异性的强糖基转移酶活性。

特别是，将刺五加苷B(丁香苷)归类为来自植物的代表性适应原，其是来自刺五加(E.senticosus)的药用成分，针对应激具有良好的心理和身体的适应效果。适应原是表示增强活体响应各种应激的非特异性抗性而不引起副作用的植物次级代谢产物的术语。近期，据报道，分离出的纯态的丁香苷对成为现代城市中生活的人的严重问题的糖尿病和抑郁症表现出良好效果，并因此其应用较以往更加广泛。然而，由于刺五加的种植范围受到限制，且因此药用成分根据种植区域有巨大的变化，因此难以具有用于商业用途的丁香苷的生产所需的刺五加的稳定供应。从而需要基于使用生物工程技术调节植物代谢途径来发展用于稳定生产植物次级代谢产物如高价值产品丁香苷的技术。

同时，韩国专利申请公开号2004-0004764公开了“包含具有肝脏保护活性的刺五加提取物或其丁醇可溶性部分和具有抗氧化和肝脏保护活性的丁香苷的丁醇馏分以及丁香脂素-双-O-β-D-吡喃葡糖苷衍生物”。此外，韩国专利申请公开号1998-0072707公开了“具有肝功能保护活性的丁香苷的药物组合物”。然而，之前从未记载本发明所公开的用于产生具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法以及由所述方法获得的植物。

本发明的详细说明

待解决的技术问题

本发明是鉴于前述需求而设计，并用于产生具有提高的糖基转移活性同时保持高水平的底物特异性的新的重组糖基转移酶。通过UGT72E2和UGT72E3基因的结构域交换(domain swapping)产生重组基因UGT72E2/3和UGT72E3/2。用花浸渍法产生了超表达每个UGT72E家族的转基因拟南芥。此外，作为丁香苷合成效率的定量分析结果，证实了新产生的重组糖基转移酶UGT72E3/2表现出比野生型UGT72E2和UGT72E3显著提高的丁香苷合成。

此外，为了通过调节植物代谢途径提高丁香苷的产生，产生了超表达F5H和HCT基因(其调节用于在类苯基丙烷合成途径中调节底物流的重要步骤)的每个拟南芥转基因植物、缺少CHS基因功能的转基因植物，以及超表达作为木质素合成途径的正调节转录因子的Myb58的转基因植物。作为在将前述的转基因植物与超表达重组糖基转移酶UGT72E3/2的转基因植物杂交后，丁香苷合成效率的定量分析结果，已发现，来自同时超表达UGT72E3/2、F5H和Myb58蛋白的新产生的转基因植物的丁香苷生成量相比仅超表达UGT72E3/2蛋白的情况提高了10倍或以上，因此完成了本发明。

解决问题的技术手段

为了解决上述问题，本发明提供了重组糖基转移酶UGT72E3/2蛋白，其由氨基酸序列SEQ ID NO:2构成。

本发明还提供了编码UGT72E3/2蛋白的基因。

本发明还提供了包含编码UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体。

本发明还提供了用重组载体转化的宿主细胞。