[发明专利]基因工程酵母细胞

说明书

技术领域

本发明涉及生产高水平的乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的酵母细胞。本发明还涉及用于制造这种酵母细胞的方法，以及这样的酵母细胞在生产乙酰辅酶A衍生的产物的方法中的应用。

背景技术

具有广泛工业利益的天然产物在工程化宿主细胞(即所谓的细胞工厂)中的生物合成可以放出这些天然资源的尚未实现的商业潜力。因此，开发可以有效地将廉价的碳源转换成所谓的前体代谢产物并进一步转化成目标产物的细胞工厂平台的兴趣与日俱增。其中的一个关键的代谢产物是乙酰辅酶A，其被用作前体用于生产各种各样的工业上感兴趣的产物，包括类异戊二烯(主要用作调味料和香料，生物柴油，抗疟药物和抗癌药，抗生素，橡胶，膳食补充剂，食品成份和维生素)、聚酮(抗生素，抗癌药和免疫抑制剂)、脂质(如膳食补充剂，药品和生物柴油)、聚羟基烷酸酯和1-丁醇(图1)。

在前一项研究中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的丙酮酸脱氢酶旁路的工程化显示增强了乙酰辅酶A的供应并增加了倍半萜化合物的紫穗槐二烯的生产(Metab Eng2007,9:160；WO2007024718)。这是通过乙醛脱氢酶的过度生产和将异源沙门氏菌(Salmonella enterica)乙酰辅酶A合成酶的变体引入宿主细胞中来达到的。

然而，仍然需要进一步提高乙酰辅酶A的生产，直至当其满足应当增加任何所需的乙酰辅酶A衍生产物的生产。本发明使用结合的推-拉-阻断策略(push-pull-block)解决了这一问题，从而提供了可用于提高生产乙酰辅酶A衍生产物的细胞工厂平台。这里通过使用由乙酰辅酶A衍生的3种不同的化合物来举例说明。

发明内容

在第一方面，本发明提供了通过将醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)的过表达修饰的酵母细胞，其特征在于进一步过表达醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶。

另一个方面，本发明提供了制备修饰的酵母细胞的方法，包括过表达醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)，其特征在于所述方法还包括过表达醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶。

又一个方面，本发明提供了一种生产升高水平的乙酰辅酶A衍生的产物的方法，其包含在有利于所述产物的生产的条件下培养本发明的酵母细胞，所述酵母细胞能够生产这样的产物。

附图说明

图1：酿酒酵母中的乙酰辅酶A代谢的简化概述。乙酰辅酶A是一个关键的初级代谢产物，其定位于三个不同的亚细胞区室：细胞质(C)、线粒体(A)和过氧化物酶体(B)。在三个区室之间没有乙酰辅酶A的直接传输，并且三个区室中乙酰辅酶A的生物合成涉及到不同的代谢路径。在线粒体中，乙酰辅酶A由丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶复合物而形成。在细胞质中，乙酰辅酶A由乙酸酯通过乙酰辅酶A合成酶而形成。在过氧化物酶体中，乙酰辅酶A可由乙酸酯(也通过乙酰辅酶A合成酶，未示出)形成，也可由脂肪酸通过β-氧化而形成。在线粒体中，在乙酰辅酶A的主要命运是通过三羧酸(TCA)循环的氧化。过氧化物酶体中的乙酰辅酶A可以通过乙醛酸循环(GYC)被转化为C4有机酸(苹果酸和琥珀酸)，所述有机酸可被转移到线粒体中通过苹果酸酶和TCA循环进行氧化。乙酰辅酶A在细胞质中的主要命运是作为细胞脂质(脂肪酸和麦角固醇)的前体。许多工业上感兴趣的生物技术产物均源自乙酰辅酶A并且大多数的这些产物合成发生在细胞质中。因此，所有这些产物的酵母细胞工厂平台应使碳重定向于细胞质中的乙酰辅酶A。