[发明专利]生物合成1,3丁二烯的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年12月2日提交的美国申请61/566,085和2012年10月17日提交的美国申请61/714,883的优先权，将其全部公开内容并入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及生物合成1,3-丁二烯的方法，并且更具体地，涉及使用一种或者多种分离的酶如去氢酶、单氧化酶、去饱和酶、脱水酶，和脱羧酶，或者使用表达这些酶中的一种或者多种的重组宿主细胞合成1,3-丁二烯。

背景技术

1,3-丁二烯(下文称为丁二烯)是用于生产合成橡胶(包括苯乙烯-丁二烯-橡胶(SBR)、聚丁二烯(PB)、苯乙烯-丁二烯胶乳(SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS)、丁腈橡胶，和己二腈)的重要单体，其在制造Nylon-66(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)中使用。

丁二烯通常作为蒸汽裂化过程的副产品产生，蒸馏成粗制丁二烯流，并经萃取蒸馏纯化(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

除了其它方法之外，有意的丁二烯也可通过以下方法制备：正丁烷和正丁烯的脱氢(Houdry方法)；和正丁烯的氧化脱氢(Oxo-D或者O-X-D方法)(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

在工业上，全球95％的丁二烯生产使用基于石化产品的给料如石脑油经蒸汽裂化过程进行。有意的丁二烯的生产效果不好，制造成本高并且工艺收率低(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

依赖于石化产品给料和对于有意的丁二烯而言的能源密集型催化步骤；生物技术经生物催化提供了替代方法。生物催化是使用生物催化剂如酶实施有机化合物的生物化学转换。

因此，针对这样的背景，很明显需要用于制造中间体(具体为丁二烯)的可持续的方法，其中所述方法基于生物催化剂(Jang等人，Biotechnology and Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。

生物来源的给料和石化产品的给料均为用于生物催化过程的可行的起始原料。

在经生物催化过程合成丁二烯中，在中等碳链长度的酶底物中产生两个乙烯基是一个关键的考虑因素。

在原核生物或者真核生物中没有已知的导致合成丁二烯的酶途径。已经提出了用于由生物质-糖产生1,3-丁二烯的三种可能的途径：(1)经巴豆酰基-CoA从乙酰基-CoA；(2)从赤藓糖-4-磷酸；和(3)经与丙二酸单酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合反应。然而，使用这些策略的信息还未有报导(Jang等人，Biotechnology and Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。

通过原核生物或者真核生物合成的最接近的类似化合物是2-甲基-1,3-丁二烯(异戊二烯)，给出短的五碳链长和两个乙烯基。异戊二烯可经两种导致前体二甲基乙烯基-PP的途径合成，即，甲羟戊酸和非甲羟戊酸途径(Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2002,66(8),1619-1627)。

甲羟戊酸途径包括一种脱羧酶，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(下文称为MDD)，其在异戊二烯的前体中产生第一乙烯基(Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2002,66(8),1619-1627)。

因此在从非天然底物合成丁二烯中可将甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)指定为候选酶。

在阐释与天然底物甲羟戊酸二磷酸相关的3-甲基的功能中，已经证实，图12(a)中所示的3-羟基-5-二磷酸戊酸的转换数k_cat为0.23±0.05[s^-1]，这与天然底物的标称的8.33±1[s^-1]形成对比(Dhe-Paganon等人，Biochemistry,1994,33,13355–13362)。另外，与底物的反应仅进展至3-羟基的磷酸化，即，未检测到脱羧产物，这暗示与天然底物相比，脱羧率至少降低300倍。总之，在稳定碳正离子过渡态中3-甲基被认为是不可缺少的(Dhe-Paganon等人，Biochemistry,1994,33,13355–13362)。