[发明专利]无机焦磷酸盐及其用途

说明书

交叉引用相关申请

本申请要求2011年12月9日提交的美国临时申请系列号61/630,345的优先权，所述申请的完整公开内容通过引用并入本文。

关于联邦资助的研究的声明

本发明是在来自USDA国家食品和农业研究院(USDA-NIFA)的拨款号2007-35203-18274和2011-67015-20025的政府支持下进行的。政府在本发明中具有某些权利。

技术领域

本发明涉及用于人工授精的组合物及使用方法。更具体地，本发明涉及用于农场动物的人工授精和人类不孕临床中的体外受精和胚胎培养的精子刺激添加剂。

背景技术

人工授精(AI)是猪和牛养殖中的常用技术。新鲜射精的公猪精液必须储存在延长剂溶液中用于在15-18℃或4-5℃保存，公牛精液必须在液氮中冷冻保存和储存之前进行延长。已经开发各种类型的延长剂溶液和化合物，以降低精子代谢活性并允许延长保存。然而，需要新型且改进的培养基和/或精子延长剂，以改善动物中的人工授精和人类中的体外受精和胚胎培养。

发明内容

在一个方面，本发明提供了包含无机焦磷酸盐(PPi)的精子保存介质。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约10μM。在又另一个实施方案中，保存介质用于保存来自猪的精子。

在另一个方面，本发明提供了包含无机焦磷酸盐(PPi)的精子转移的介质。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM。

本发明的另一个方面提供了包含无机焦磷酸盐(PPi)的体外受精(IVF)或人工授精(AI)的介质。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM。

在另一个方面，本发明提供了精液性别鉴定方法，其包括：(a)在洗脱介质的帮助下将第一培养介质中的混合的精子悬浮液分为具有x或具有y的精子的群体；(b)在第二培养介质中保存具有x或具有y的精子，其中，将无机焦磷酸盐(PPi)添加至第一培养介质、洗脱介质或第二培养介质中。

在又另一个方面，本发明提供了精子保存的方法，其包括在包含无机焦磷酸盐(PPi)的介质中储存精子。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在其它实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM，或PPi的浓度为约10μM。在又另一个实施方案中，将精子在包含PPi的介质中储存最多达10天。

本发明的另一个方面提供了体外受精(IVF)的方法，其包括在无机焦磷酸盐(PPi)存在的情况下将卵母细胞与精子接触。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM。在另一个实施方案中，在PPi存在的情况下储存精子。

在另一个方面，本发明提供了培养胚胎的方法，其包括在包含无机焦磷酸盐的介质中培养胚胎。

在又另一个方面，本发明提供了人工授精的方法，其包括将精子和无机焦磷酸盐(PPi)提供至雌性的生殖道。在一个实施方案中，将PPi逐渐释放到雌性的生殖道。

本发明的另一个方面提供了体外成熟卵母细胞的方法，其包括在包含无机焦磷酸盐的介质中培养卵母细胞。

附图说明

图1：显示通过荧光分析测量焦磷酸盐(PPi)含量。(A)PPi标准品(最终浓度0-200μM PPi)的荧光强度。(B)用公猪精浆(SP)、猪输卵管液(pOVF)、兔血清、小鼠血清(最终浓度10μg/ml)、公猪精子(1x10⁶个精子/ml)和10mM H₂O₂工作溶液(阴性对照)的PPi测定。在多个时间点测量荧光强度以遵循反应动力学(激发530nm；发射590nm)。重复实验三次。值表示为荧光强度的平均值。

图2：显示PPi的生成。PPi由细胞中ATP水解成AMP而产生。无机焦磷酸酶(PPA1)催化PPi的水解，以形成2个正磷酸盐(2Pi)，导致能量释放。