[发明专利]高密度荧光染料簇

说明书

技术背景

荧光染料广泛用于生物分析(例如，DNA和蛋白质微阵列、DNA/RNA/蛋白质印迹等)、成像(共焦、外荧光、病理学、活的和固定的体外细胞、体内全体等)和诊断(例如，体外诊断、夹心分析、侧流分析)。增强荧光染料的信号强度对荧光的这些用途是有益的，用于增强灵敏度(例如，发现低丰度靶分子)或增加通过量(例如，减少的成像积分时间)。提高信号强度的最简单方法是增加荧光团浓度。然而，这种方法对于常规荧光染料通常是不可能的，因为染料分子在高浓度下电相互作用并猝灭信号。这是对于溶液中游离染料和结合到生物分子或表面的染料二者的情况。因此，由于在足够高局部浓度(例如，多个染料在单一抗体上)猝灭，任何信号增益被信号损失抵消。传统荧光染料的另一个缺陷包括染料通过光源光漂白或光氧化成非荧光形式，这导致染料降解和荧光信号损失。光漂白的速率和方式通常受与溶剂分子(例如，水)相互作用的影响。在照明下光漂白限制染料寿命，在多个时间点需要长积分时间或图像时，这不利地影响底物的成像或检测。

因此，由于传统荧光染料的这些缺点，需要能够产生强的长持续信号的新荧光染料。

发明概述

本发明涉及模块空间增强发射染料(SEED)簇，其中将多个SEED分子附加到单一聚合物链上。本发明的簇围绕在高染料密度下猝灭的染料，因此允许较高染料密度和作为附加到链的染料数的函数的较高信号强度(例如，>1Ox单独荧光团)。通过限制染料-溶剂相互作用的水溶性染料簇的核-壳结构，也使光漂白和氧化破坏最大限度地减小。

附图简述

图1为用于细胞标记的SEED簇(左)的一个实施方案的示意图，显示缀合到与共同骨架(右)结合的SEED荧光团链的生物分子(抗体，中)。

图2为水溶性链-结合SEED簇的荧光光谱(左)，和归一化吸收(峰)和发射(峰)的比较，显示浓度和发射之间线性相关，表明在结合到各簇的分子之间正在发生SEED效果，并且在高浓度下没有浓度介导的猝灭。

发明详述

本文所述的本发明的簇避免常规荧光染料的几个关键缺点。一个优点是增加每簇亮度，因为多个染料分子结合到单一簇。簇包含用于连接到生物分子或其它主体的缀合部位，使得簇可按与常规荧光团相同的方式连接。另外，本发明的簇的光稳定性以两种方式改善。首先，本发明的染料分子相对疏水，并以聚集状态存在于水溶液中，这使染料分子不易受溶剂介导的光氧化反应影响。其次，在单一簇中结合多个染料分子保证在簇内单一染料随机闪烁或光漂白的情况下，簇整体上亮度仅仅略微下降，而不是完全消失(完全消失是常规荧光团的情况)，使得用簇标记的靶能够对于成像或检测保持可见。

本发明的染料簇的另一个优点包括其模块性质，这使得能够以控制方式整合不同的功能性，以产生多功能探针。例如，结合光稳定部分增加寿命，结合环境响应部分能够感测，小分子靶向剂提高特异性。预料结合多种染料产生分化，并提高信号强度，同时保持那些染料的已知光学和化学性质。这些模块簇的所得性质促进工作流，并改善分析结果。

在本发明中使用的染料分子包括可以“空间增强发射染料”(SEED)或者“聚集诱导发射体”(AIE)为特征的任何染料。SEED是一类染料，其显示随增加染料浓度，荧光量子产额的非线性增加，而没有如常规染料中见到的由于猝灭导致的信号损失(见Y. Hong, J. Lam, B. Z. Tang, Aggregation-Induced Emission: Phenomenon, Mechanism and Applications(聚集诱导发射：现象、机理和应用), ChemComm, 2009, 4332-4353, 其教导全文通过引用结合到本文中)。不希望受理论限制，SEED分子一般包含缀合到分子的荧光中心但能够围绕键轴旋转的取代基。作为溶液中的游离染料，这种旋转对于染料吸收的能量产生非辐射衰减通道，从而导致染料在溶液中游离时实质上为非荧光性。当通过与相邻染料分子相互作用或包封在刚性基质来阻止分子内旋转时，分子的荧光量子产额显著增加，同时侧基防止与相邻染料的电子作用，使得染料分子能够发射而不猝灭。除非另外说明，在本文中对“染料”的引用是指能够归类为SEED分子的染料。