[发明专利]用于合成的双向SCBV植物启动子的方法和构建体

说明书

优先权要求

本申请要求2011年12月30日提交的美国临时专利申请流水号61/582,148的申请日的权益。本申请还要求2012年5月3日提交的美国临时专利申请流水号61/641,956的申请日的权益。

发明领域

本申请一般涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及多个基因在转基因植物中稳定表达的领域。

技术领域

本申请一般涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及多个基因在转基因植物中稳定表达的领域。

发明背景

许多植物物种可以用来自其他物种的转基因转化以引入农学上期望的性状或特征，例如改善营养价值品质、提高产率、赋予害虫或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量(如着色和生长)、给予除草剂抗性、使得能够从植物产生工业上有用的化合物和/或材料、和/或使得能产生药物。将转基因导入到植物细胞、随后复原含有稳定整合的转基因拷贝的可育转基因植物的做法，可以用来产生拥有期望性状的转基因植物。

基因表达的控制和调节的运行机制众多。基因的转录启动是基因表达的主要控制机制。转录的启动一般由位于所转录基因的5’侧翼或上游区中的多核苷酸序列控制。这些序列统称为启动子。启动子通常含有用于使RNA聚合酶开始转录的信号，使得能够产生信使RNA(mRNA)。成熟的mRNA被核糖体翻译，由此合成蛋白质。DNA结合蛋白与启动子DNA序列特异性相互作用以促进转录复合物的形成并启动基因表达过程。有多种从植物分离并得以表征的真核生物启动子，其对于驱动植物中的转基因表达是有功能的。已分离和表征了应答环境刺激、营养可用性、和包括热休克、厌氧生活或存在重金属在内的不利条件而影响基因表达的启动子。还有在发育期间或以组织或器官特异性方式控制基因表达的启动子。另外，已从细菌和病毒分离和表征了原核生物启动子，这些分离的原核生物启动子对于驱动植物中的转基因表达有功能。

典型的真核生物启动子由最小启动子和其他顺式元件组成。最小启动子实质上是一个TATA框区，RNA聚合酶II(polII)、TATA结合蛋白(TBP)和TBP相关因子(TAF)可在此结合而启动转录。然而，在大多数情况下，准确的转录需要TATA基序以外的序列元件。已发现这类序列元件(例如增强子)提高临近的基因的总体表达水平，且往往是以不依赖位置和/或取向的方式。在一些polII基因的转录起始位点附近的其他序列(例如INR序列)可以为其他促进转录活化的因子提供可变剪接位点，在缺少功能性TATA元件的启动子中，其甚至可替代地提供转录的核心启动子结合位点。参见例如，Zenzie-Gregory等(1992)J.Biol.Chem.267:2823-30。

其他基因调控元件包括与特定DNA结合因子相互作用的序列。这些序列基序有时称为顺式元件，且通常是位置和取向依赖性的，尽管它们可见于基因编码序列的5’或3’侧或内含子中。这类顺式元件，组织特异性或发育特异性转录因子结合的单独或组合地与它们结合，可以决定启动子在转录水平上的时空表达模式。上游顺式元件后随最小启动子的排列方式通常会产生具体启动子的极性。已克隆并广泛用于基础研究和生物技术应用的植物中的启动子一般是单向的，仅指导融合于其3’端(即下游)的一个基因。参见例如，Xie等(2001)Nat.Biotechnol.19(7):677-9；美国专利No.6,388,170。

在植物启动子中已鉴定出许多顺式元件(或“上游调节序列”)。这些顺式元件施加于与其可操作连接的基因的控制有很大不同。一些元件作用于提高可操作连接的基因应答环境响应(例如温度、湿度和创伤)的转录。其他顺式元件可能对发育线索(developmental cue)(例如萌发、种子成熟和开花)或空间信息(流例如组织特异性)应答。参见例如，Langridge等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-23。特定启动子元件的控制类型通常是启动子的内在性质；即，在这类启动子控制下的异源基因很可能依照该启动子元件所来源的天然基因的控制来表达。这些元件通常还可与其他元件交换并维持其对基因表达的特征性内在调控。