[发明专利]超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用

权利要求书

1.一种筛选可溶性靶蛋白的方法，所述方法包括：

(1)用Tat相关蛋白质改造工程载体pET-TAPE表达编码融合蛋白的基因构建体，所述基因构建体包含连接到靶蛋白的N末端的Tat底物蛋白大肠杆菌三甲胺-N-氧化物还原酶即TorA的途径信号序列和连接到靶蛋白的C末端的TEM-1β-内酰胺酶，将所述基因构建体转化至包含一种或多种宿主细胞的宿主细胞群中；

(2)接种所述宿主细胞群于含有抗生素的液体培养基中；

(3)从所述含有抗生素的液体培养基选择存活的宿主细胞以收集质粒DNA；

(4)从收集的质粒DNA中收集编码靶蛋白的核酸序列；

(5)从收集的核酸序列中确认并筛选靶蛋白的序列；和

(5’)再次用pET-TAPE载体转化宿主细胞，向所述pET-TAPE载体引入了所收集的核酸序列，或(5”)直接用含有所收集的核酸序列的收集的质粒转化宿主细胞，而不制备单独的pET-TAPE载体，

其中所述可溶性靶蛋白是免疫球蛋白可变结构域或抗体片段。

2.根据权利要求1的方法，其中所述靶蛋白是免疫球蛋白的重链可变结构域。

3.根据权利要求1的方法，其中所述融合蛋白还包括用于分离、纯化或检测与其连接的氨基酸标签。

4.根据权利要求3的方法，其中所述氨基酸标签选自6xHis标签、FLAG标签和c-myc标签。

5.根据权利要求1的方法，其中所述载体是pET22b或者pET9a。

6.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

7.根据权利要求1的方法，其中在宿主细胞群中包括的宿主细胞转化有分别编码各包括不同的靶蛋白的融合蛋白的基因构建体。

8.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌菌株。

9.根据权利要求1的方法，其中，阶段(1)至(5')或阶段(1)至(5”)被重复两轮或更多轮。

10.根据权利要求1的方法，其中所述抗生素是氨苄青霉素或羧苄青霉素。

11.根据权利要求1的方法，其中所述抗生素是在重复所述轮时以逐渐增加的浓度加入。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗生素在初始轮时具有0.05至0.2μg/ml的浓度。