[发明专利]纤维环与髓核一体化复合双相支架及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物组织工程技术，具体是一种纤维环与髓核一体化复合双相支架及其构建方法

背景技术

生物组织工程方法主要包括支架材料、种子细胞和信号因子三要素，其中，支架材料是组织工程构建的关键环节。理想的组织工程椎间盘支架材料除了具备良好的生物相容性，良好的孔隙结构，以及适当的降解性能等共性以外，还应该在成分、形状、结构、力学性能上与人椎间盘细胞外基质相似。

椎间盘结构复杂并有很高程度的异质性，含有髓核与纤维环两个发育上和形态上不同的区域，由不同的细胞和细胞外基质组成。目前对于组织工程椎间盘支架材料的研究多停留在分别构建组织工程纤维环支架（AF）和组织工程髓核支架（NP）上，早期用于椎间盘组织工程的支架材料有藻酸盐、琼脂糖、透明质酸、以及聚乳酸聚羟基乙酸共聚物（PLGA）等，后来则倾向于应用类似椎间盘细胞外基质的含有胶原和蛋白聚糖成分的材料，如I型胶原/透明质酸复合支架、Ⅱ型胶原/透明质酸凝胶复合支架、Ⅱ型胶原/透明质酸/6-硫酸软骨素、脱细胞小肠粘膜下层（SIS）等,尚缺乏对一体化AF-NP支架材料的研究。

美国Mizuno课题小组创新性用聚乙醇酸-聚乳酸材料（PGA /PLLA）制成椭圆形的纤维环外形支架，并种植羊纤维环细胞，其中心部注入以藻酸盐凝胶复合的髓核细胞，从而制成一椎间盘样组织工程化复合物并植入裸鼠背部皮下培养。结果表明培养组织的大体形态与正常椎间盘相似；组织学结果表明培养组织外周的类纤维环组织多含有I型胶原而中央的类髓核组织中多含有II型胶原，这和正常椎间盘组织中的分布特点类似；生化成分检测结果表明DNA、GAG以及胶原的含量在16周超过正常组织的50%；生物力学检测结果表明生成的椎间盘样组织弹性模量增加了4倍，仍低于正常的椎间盘组织；该研究培养的椎间盘组织，无论形态大小还是力学性能，距离能够真正临床应用的椎间盘组织相差甚远（Mercuri JJ, Gill SS, Simionescu DT. Novel tissue-derived biomimetic scaffold for regenerating the human nucleus pulposus. J Biomed Mater Res A, 2011, 96(2): 422-435.），但以上研究表明构建工程化纤维环与髓核复合组织是构建一体化椎间盘的可行方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中仅有单一组织工程纤维环支架或组织工程髓核支架的不足，提供一种同时适合纤维环细胞和髓核细胞生长要求的生物组织工程纤维环与髓核一体化复合双相支架及其制备方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种纤维环与髓核一体化复合双相支架，包括纤维环和髓核，该双相支架的外周是松质骨制备的脱细胞脱钙骨基质明胶，中央是髓核组织制备的脱细胞髓核基质。

所述纤维环与髓核一体化复合双相支架，所述的松质骨是猪股骨头松质骨。

所述纤维环与髓核一体化复合双相支架，所述的髓核组织是猪尾髓核。

一种纤维环与髓核一体化复合双相支架的构建方法，其是以下步骤构建的：

a、制备脱细胞脱钙骨基质明胶纤维环

取猪股骨头松质骨，修整成纤维环形状后，依次在室温条件下进行脱细胞脱钙处理：

（1）、用体积比为1:1的氯仿甲醇混合液与松质骨按1g/30ml的比例浸泡24h；       

（2）、用0.6mol/L的HCl浸泡48h；

（3）、2 mmol/L CaCl₂浸泡1h；

（4）、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)浸泡1h；

（5）、8 mmol/L的LiCl浸泡1h；

（6）、5% Triton X-100浸泡24h；

（7）、去离子水反复冲洗，即得；

b、制备脱细胞髓核基质微丝悬液

（1）、将猪尾椎间盘髓核组织放入含0.6%TritonX-100和1.0%脱氧胆酸的Tris－HCL缓冲液中，超声频率42 kHz±6%，处理10分钟，过滤去除骨屑杂质；

（2）、放入含0.6%TritonX-100和1.0%脱氧胆酸的Tris－HCL缓冲液中，室温持续震荡72h，150r/min，每隔24h换液一次、超声10分钟，去离子水冲洗干净；

（3）、将髓核组织用含720mU/mL DNaseⅠ和720mU/mL RNase A的PBS消化液37℃消化48小时，去离子水冲洗干净；