[发明专利]一种MnSOD-Hemolin融合蛋白及其结晶方法

权利要求书

1.一种MnSOD-Hemolin融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种权利要求1所述MnSOD-Hemolin融合蛋白的结晶方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1) Hemolin基因的获得；

2)重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin的构建；

3)重组蛋白的表达；

4)重组蛋白的初步纯化；

5)重组目的蛋白的进一步纯化；

6)重组目的蛋白的结晶。

3.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 

1)通过设计引物，以家蚕蚕蛹cDNA为模板扩增，获得Hemolin基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示;

2)将步骤1)所得Hemolin基因连接到pET-28a-MnSOD载体中，构建重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin；

3)将步骤2)所得重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin导入大肠杆菌BL21中，诱导表达获得大量重组蛋白；

4)将步骤3)所得重组蛋白与镍离子亲和层析柱结合，然后用20mM/L的咪唑洗杂蛋白，200mM/L的咪唑洗脱重组目的蛋白；

5)将步骤4)所得重组目的蛋白浓缩后，利用superdex 75进一步分离纯化，得到较纯的重组目的蛋白;

6)收集步骤5)中的第一个峰的所有溶液，并浓缩，将浓缩好的蛋白用于点晶。

4.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤1)中扩增方法为PCR扩增方法。

5.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤3)中，将步骤2)所得重组表达载体pET-28a-MnSOD-Hemolin转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin，将该重组基因工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中于37℃，220 rpm振荡培养至OD600=0.5时，加终浓度为1mM 的IPTG，37℃诱导培养4h，获得大量重组目的蛋白。

6.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤4)中，将步骤3)所得基因重组工程菌pET-28a-MnSOD-Hemolin扩大培养，之后于4℃下6000rpm离心30min，弃去培养基，沉淀即为菌体，然后超声破碎，于4℃下12000rpm离心30min，分为沉淀和上清，将含有目的蛋白的上清溶液过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，然后用20mM/L的咪唑溶液洗杂蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白。

7.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤4)中，将步骤3)所得重组目的蛋白通过0.45μm纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，然后用20mM/L的咪唑溶液洗杂蛋白，200mM/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白。

8.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤5)中，将步骤4)所得目的蛋白经过50kD的超滤管浓缩，利用Superdex 75进一步分离纯化，得到较纯的目的蛋白。

9.如权利要求2所述的结晶方法，其特征在于，所述步骤6)中点晶具体包括：

(1)对24孔晶体培养板上的小孔进行编号，每一个编号小孔对应一个的蛋白结晶试剂盒筛选的条件，每个小孔中依次加入200 μL不同试剂盒中不同条件的结晶缓冲液，参考MnSOD-Hemolin的蛋白性质预测信息，共使用了500个蛋白结晶的条件；

(2)用结晶专用移液器吸取1 μL纯化后的目的蛋白样品，然后滴在硅化盖玻片上，每个盖玻片上点3个不同浓度的目的蛋白样品；同时要在每个点好的目的蛋白样品中滴入1 μL的结晶缓冲液，将其混匀；

(3)将上述滴有目的蛋白样品和结晶缓冲液的盖玻片翻转垂直盖于24晶体孔培养板的相应小孔上；等加完所用的目的蛋白样品和结晶缓冲液后，盖上24孔板的板盖；并将上述蛋白晶体培养板放于16℃的晶体培养室中培养。