[发明专利]南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法

权利要求书

1.南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）样品采集；

（2）TSV的DNA和WSSV的RNA的提取，以及WSSV的逆转录cRNA的合成；

（3）TSV引物和WSSV引物的设计与合成；

（4）将步骤（2）的核酸和步骤（3）的引物加入PCR反应体系，建立PCR反应体系，并进行多重PCR试验；

（5）将步骤（4）的扩增产物进行特异性和敏感性测试。

2.根据权利要求1所述的南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）样品采集：随机抽取疑似TSV和WSSV感染的南美白对虾，在-80℃下冷冻处理；

（2）核酸的提取：

① TSV的RNA的提取：取疑似TSV发病对虾内脏组织约0.1g，加入1ml Trizol, 在4℃下12000g离心10min，得上清液;将上清液在15～30℃孵育5min; 加入0.2mL氯仿，振荡、孵育; 在4℃下12000g离心15min；将离心后的上层无色水相加入0.5mL异丙醇，震荡，孵育10min; 在4℃下12000g离心10min，去上清，加入至少1mL75%乙醇，涡旋振荡; 在4℃下7500g离心5min，室温晾干RNA，加入无RNase的水溶解RNA，55-60℃孵育10min, 溶解，备用；

② TSV的cDNA的合成：在PCR反应管中加入5μL的上述桃拉病毒RNA模板，加入随机引物10～20ng, 70℃孵育5min后，依次加入4μL 5×M-MLV Buffer，RNA酶抑制剂和dNTP各1μL，M-MLV酶1μL，最后双蒸水补足20μL；42℃反应1h，然后70℃灭活M-MLV酶10min，立即冰浴10min，得到cDNA，保存于－80℃备用；

③ WSSV的DNA的提取：取疑似WSSV发病对虾内脏组织共约0.1g，加入200μL裂解液(0.4M NaCl，10mM Tris-HCl, 2mM EDTA, PH 8.0) 研磨均匀后补加100μL裂解液，6000g 离心去杂质及细胞碎片，取上清液；在上清液中加入30μL 20%SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K混合均匀，在55℃温度下培育1～2h后，加入苯酚/氯仿/异戊醇（质量比为25:24:1）混合液，去除残余蛋白，离心后取上清；加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液等体积异丙醇混匀，-20℃下沉淀30min，10000g在4℃离心10min，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20μL双蒸水中，并于-20℃备用；

（3）TSV的RT-PCR检测引物：5'-GCTTGCGTGGTGGGACTTA-3'，5'-TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG-3'；WSSV的PCR检测引物：

5’-TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT-3’，5’-CACGAG TCTACCGTCACAACATC -3’；

（4） PCR反应体系建立和多重PCR试验：

①1μL的TSV的RNA和WSSV的DNA分别加入PCR反应体系12.5μl（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司），再分别加入TSV和WSSV引物正向及反向各0.5μl，加重蒸馏水至终体积25μL，进行扩增；

②桃拉病毒1μL逆转录cDNA模板和白斑病毒1μLDNA模板，加入PCR反应体系25μl，加入桃拉病毒和白斑病毒引物正向及反向各0.5μL，加重蒸馏水至终体积50μL，另外设立阳性对照和的阴性对照，将反应管置于PCR仪上进行扩增；

（5）特异性和敏感性测试：TSV和WSSV核酸模板的样品与对虾其他病原核酸样品，分别加入到PCR反应体系中进行扩增，测其特异性；将抽提的WSSV的DNA和TSV的RNA作为模板分别测其含量后，将核酸作l0倍系列稀释，并对上述模板进行多重PCR扩增以检测其敏感性；将PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳富集，回收目的片段，将纯化后的PCR产物进行测序。

3.根据权利要求2所述的南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）中，扩增条件为：94℃5 min，1个循环；94℃45S，55℃45S，72℃ 1 min，35个循环；72℃10min，1个循环。

4.根据权利要求2所述的南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）中，扩增条件为：94℃1 min，1个循环；51℃1min，72℃1min，94℃ 30S，35个循环；51℃:  1 min ,72℃ 5 min，1个循环。