[发明专利]一种甲醇蛋白发酵滤液再利用的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是一种甲醇蛋白发酵滤液再利用的方法。 

背景技术

应用发酵法生产单细胞蛋白作为饲料，在国内已有很多报导，且有成熟的加工方法，如用假丝酵母、毕赤酵母等作为发酵菌种，以甜菜渣、啤酒糟、柑橘废渣、糖蜜等一些加工副产品生产的单细胞蛋白。以甲醇为基质通过单细胞生物获得的单细胞蛋白，目前国内外的生产方法主要有细菌发酵法和酵母菌发酵法，细菌法包括英国的ICI法、德国的Hoechst-Uhde法和瑞典的Norprotein法；酵母菌种生产法包括日本的MGC法、法国的IFP法和美国的Philips Petroleum法，除ICI法工业化生产外（目前已停产），其他均未工业化，但目前在我国对于单细胞甲醇蛋白饲料的开发还刚刚起步，特别是发酵液的循环再利用问题，目前还没有任何有关报导，由于发酵在整个单细胞甲醇蛋白工业化生产过程中，是必不可少的步骤，由此而产生的发酵滤液的产出量比较大，大多发酵厂家直接将发酵滤液排掉，不仅给环境造成污染，还使得滤液中部分可再次利用的物质没有得到有效的利用，造成极大的浪费。 

发明内容

本发明之目的就是提供一种甲醇蛋白发酵滤液再利用的方法，可有效解决单细胞甲醇蛋白工业化生产中发酵液的循环再利用问题。 

本发明解决的技术方案是，将按常规方法或用巴斯德毕赤酵母HGD-01生产甲醇蛋白所得的发酵液静置，沉降进行离心，过滤，得过滤液和菌体蛋白液，菌体蛋白液中加水，搅拌均匀，喷雾干燥，收集蛋白干粉；过滤液进行回收利用，根据回收利用的次数的不同，每一次回收利用过程中在每升过滤液内添加乙二胺四乙酸（EDTA）的量在0.5 g/L-1.3 g/L内依次递增，用过滤液和乙二胺四乙酸（EDTA）混配成混合液，根据回收利用的次数的不同，在每一次回收利用过程中，用混合液分别与上述步骤中BSM无机盐发酵培养基配方中磷酸、无机盐、微量元素溶液用量的10-20%的磷酸、10-20%的无机盐、10-20%的微量元素溶液和甘油25kg/m³混配成替代培养基，用替代培养基代替原甲醇蛋白生产过程中使用的发酵培养基，过滤液回收利用一般可进行三次，第三次过滤液不再回收利用；所述的用巴斯德毕赤酵母HGD-01生产甲醇蛋白所得的发酵液的具体步骤是：巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，培养得斜面种子，斜面种子接种到摇瓶YPD液体培养基中培养，获得摇瓶种子；将摇瓶种子接种到YPD液体培养基中，培养得一级种子；一级种子接种到BSM无机盐发酵培养基中，培养得二级种子；将二级种子接种到发酵培养基中进行发酵，发酵24小时后，开始流加甲醇，控制甲醇浓度，45-50小时后，菌体湿重达到250-300 g/L，OD₆₀₀值达到42～45，即得发酵液。 

本发明大大减少了无机盐的投入，每次甲醇蛋白的生产，可减少80-90%的无机盐的使用量，并降低了废水的排放，节约了水资源，降低了原料成本，且不影响酵母细胞的生长和甲醇蛋白产率，提高了生产效率，产生可观经济效益和社会效益。 

具体实施方式

以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。 

一种甲醇蛋白发酵滤液再利用的方法，包括如下步骤： 

1）、摇瓶种子培养：

分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342，保藏日期为：2012年9月12日；

在超净工作台（仪器型号SW-CJ-1FD）上将甘油管保藏的0.5mL巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株用划线法接种至YPD试管斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，30℃培养48小时，即得斜面种子；取1支培养好的斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有250mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养约24～30小时后，菌体OD₆₀₀达到3～5，获得摇瓶种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%胰蛋白胨（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；

2）、一级种子培养：