[发明专利]一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法。

背景技术

组织工程皮肤是目前组织工程领域的热点，近年来已经有许多产品应用于临床。组织工程皮肤研发中需要解决的一大问题是种子细胞（即表皮细胞与成纤维细胞）的大规模体外培养。

传统的成纤维细胞培养是在基础培养基中添加血清，但是血清的使用会带来风险隐患：①血清中含有细胞生长抑制因子和毒性因子，有潜在细胞毒性；②血清组分复杂，批次间质量存在差异，增加了产品质量控制的难度和不稳定性；③目前血清中各组分及其含量对细胞生长、增殖的作用机制尚不清楚，给研发和应用带来不便；④从安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物（如引起牛海绵状脑炎的朊病毒），给血清的使用带来了不容忽视的安全隐患；⑤由于血清培养基中的蛋白质很难通过普通分离方法彻底去除，，从而造成细胞表达产物分离纯化难度较高，严重影响产品的最终质量。这些不利因素促使了培养方法的改进，用无血清细胞培养基替代血清培养基。

目前针对无血清培养基的研发主要集中在以下几种细胞：疫苗生产细胞（例如中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞等）、干细胞（例如间充质干细胞、胚胎干细胞、表皮干细胞等）和其他细胞（如神经细胞、内皮细胞、软骨细胞等）。无血清培养基针对性很强，没有广泛的适应性，同类型的细胞、甚至不同细胞系或细胞株都可能有各自的无血清培养基，对无血清培养基的适应往往不同。成纤维细胞因其增殖具有血清依赖性，在无血清条件下培养较为困难，所以目前针对成纤维细胞的无血清培养基很少，仅有少数外国企业的无血清培养基，主要有：ATCC公司的Fibroblast Growth Kit Serum-Free，Sciencell公司的Fibroblast Medium-serum free(FM-sf)和HyClone公司的FetalClone? III等产品。国内尚无同类产品，也未见文献或专利公开有用于成纤维细胞的无血清培养基的详细资料。

目前，用于其他细胞培养的无血清培养基存在的共同问题：①白蛋白作为血清的主要成分，是无血清培养基中普遍的添加成分，由于牛血清白蛋白（BSA）为动物源性蛋白，可能携带致病因子；目前的无动物源性培养基多是采用重组白蛋白（HSA）替代BSA，导致培养基成本较高。②血清中含有多种贴壁因子，依赖血清的细胞在无血清培养时则不易贴壁，所以在无血清培养贴壁细胞时，需要提前包被贴壁因子，增加了操作的复杂性，而且常用的贴壁因子（如胶原、多聚赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白等）价格昂贵，提高了培养基成本。③多数无血清培养基的使用需给细胞一个适应过程，逐步降低培养基中血清浓度，最终过渡到无血清培养；另外，在用于原代培养时，还需要额外添加2％的血清，使其不成为真正意义上的无血清培养。④无血清培养基传代次数较少，例如，ATCC公司的Fibroblast Growth Kit Serum-Free培养基在说明书中明确指出，培养10代之后细胞增殖速率减缓。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对成纤维细胞培养的无血清培养基，其中不添加白蛋白和贴壁因子，能够避免血清中复杂成分造成的潜在隐患，使成纤维细胞接近在含血清培养基中的生长增殖状态，从而满足规模生产和应用的需要。

本发明所提出的无血清成纤维细胞培养基是由基础培养基与外源添加物组成，其中，基础培养基为DMEM商用培养基，或DMEM商用培养基与F12商用培养基的混合培养基；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。

所述的混合培养基按体积比DMEM培养基为1～3份、F12培养基为1份；所述的外源添加物为：胰岛素或胰岛素样生长因子（IGF）为1～20 mg/L，转铁蛋白为1～20 mg/L，谷氨酰胺为1～10 mM，三碘甲状腺氨酸（T3）为0.01～5μM，氢化可的松为0.01～5mg/L，地塞米松为0.01～10μg/L，乙醇胺为5～30μM，腺嘌呤为5～30 mg/L，葡聚糖为10～30g/L，亚硒酸钠为1～15μg/L，2-巯基乙醇为50～100μM，维生素E（V_E）为2～20mg/L，维生素C（V_C）为2～50mg/L，脂类浓缩剂为1mL/L，碱性成纤维生长因子（bFGF）为1～50μg/L，表皮生长因子（EGF）为1～10μg/L，转化生长因子（TGF-β）为1～10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1～10μg/L。