[发明专利]一种脱细胞角膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程学生物医用材料技术领域，具体涉及一种脱细胞角膜的制备方法。

背景技术

角膜是维持人体正常视力最重要的组织之一。角膜会由于发生圆锥角膜、大泡性角膜、真菌感染、外伤瘢痕等疾病造成视力下降或失明，现今角膜盲已成为全球第二大致盲性疾病。目前治疗角膜盲最为有效的方式是异体角膜移植，然而异体角膜来源的缺乏造成大量患者得不到及时治疗而最终失明。据统计全球有超过1000万的人口遭受角膜盲疾病，然而仅有不到12万的患者能够接受异体角膜的移植治疗。

为解决临床角膜供体不足的问题，人们试图用高分子合成材料或天然衍生材料构建人工角膜。高分子合成材料通常包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等，由于这类材料生物相容性差，不能实现与宿主植床的融合，不是理想的人工角膜材料。如最具代表性的波士顿人工角膜，该角膜只能应用于异体角膜移植反复失败、高危植床等有限的适应症上，由于该角膜产品属于一种特殊屈光装置，不具生物活性，在移植后的外观和受体的舒适感与自然角膜差异很大。理想的人工角膜应有好的生物相容性、透明度、低免疫原性。天然衍生材料由于具有良好的生物相容性，被广泛用于人工角膜的制备，如胶原、胶原与糖胺聚糖混合体、胶原与壳聚糖混合体等。天然衍生材料制备的人工角膜最具代表性的是AlphaCor^TM，该角膜是由经过交联的胶原制备而成，与人天然角膜有类似的外形和机械性能，该角膜产品已应用于临床。经长期观察发现，AlphaCor^TM在移植后会出现缓慢的角膜基质降解，并出现难以上皮化的现象，主要原因是其无法模拟天然角膜的超微结构。天然角膜从外至内是由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层组成，其中基质层是由有序的胶原束与蛋白聚糖排列组成的透明组织，胶原束直径为22～32nm，间距约30nm，该空间距离是由胶原与蛋白聚糖分子中的氢键所维持，这种结构能阻止散光发生，并为角膜提供特殊生物力学性能以抵御眼内压力。迄今为止，还无法利用生物材料在体外模拟角膜如此精密复杂的结构。

随着脱细胞技术的快速发展，通过对天然组织的处理，去除天然组织中的细胞及其他抗原成分，并保留天然组织中细胞外基质成分以及空间结构。脱细胞技术已广泛应用于血管、皮肤、心脏瓣膜、神经等组织，脱细胞的天然组织也被用于组织损伤修复。目前已有脱细胞天然组织广泛应用于临床，并取得了良好的组织修复效果。

天然猪角膜与人角膜有着高度相似的组织生理结构，因此猪角膜已被研究作为原料制备脱细胞角膜，并作为异体角膜替代物用于角膜板层移植。最初脱细胞的方式是采用TritonX100联合胰酶进行处理，该方法虽然能够完全去除组织中的细胞，但对天然角膜的胶原微结构和糖胺聚糖成分破坏严重，致使处理后的角膜丧失了天然角膜大部分的组织特性，移植后与组织融合效果较差，无法达到治疗目的。为了避免角膜基质结构的严重破坏，又有仅采用去污剂（例如TritonX100、十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠等）进行脱细胞处理，但十二烷基磺酸钠等离子型去垢剂仍对组织有很大程度破坏，且去垢剂的残留难以洗脱，容易造成脱细胞角膜的细胞毒性。此外有采用特异性破坏细胞膜的磷脂酶代替广谱性酶进行脱细胞处理，仍难以达到完全去除细胞抗原的目的，移植后会诱发较强的免疫宿主反应；因此采用与去垢剂（例如脱氧胆酸钠）联合使用，仍无法避免对天然角膜基质的影响，且磷脂酶非常昂贵，难以实现脱细胞角膜的产品化。日本学者采用低温高压法对猪角膜进行处理，达到了脱细胞效果，但是高压法对设备要求非常严苛，且高压条件下角膜的胶原也会产生变性，影响脱细胞角膜的治疗效果。

为避免化学去垢剂与生物酶对脱细胞角膜微结构的损害，有学者采用交联方法加强角膜结构，传统的交联剂（如戊二醛、EDC等）会使角膜基质整体结构全部交联，导致角膜基质失去天然角膜的弹性和韧性，更严重的是导致角膜基质的生物相容性下降，移植后不与植床融合，最终被宿主排斥。

因此要保留天然角膜的透明性与机械性能达到更好的角膜修复效果，需要摆脱现有的角膜脱细胞技术，建立全新的角膜脱细胞工艺。

发明内容

针对现有技术的存在问题，本发明的目的是提供一种脱细胞角膜的制备方法，所制备的脱细胞角膜具有天然角膜的基质层和前弹力层，保留了天然角膜的物理化学性能，生物相容性好、透明度好，可替代异体角膜进行板层角膜修复。

本发明提出的脱细胞角膜制备方法，包括脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护与灭菌的步骤，具体如下：