[发明专利]一种验证CIDEC基因5端调控区单核苷酸多态性位点遗传效应的方法与应用

权利要求书

1.黄牛CIDEC基因（AC_000179.1）5端调控区有十处SNP位点：g.-501G>A;-546T>C;-643T>G;-714T>C;-727C>T;-762C>T;-763C>T;-841T>C;-956G>A;-974C>T，这十处SNP位点在南阳牛群体中共形成了九种单倍型，其中单倍型5，6，7频率过低，所以在转录活性分析中只分析了单倍型1，2，3，4，8，9六种。

2.黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法包括以下步骤：

（1）以包含CIDEC基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，使用引物P来扩增黄牛CIDEC基因不同单倍型；

（2）对步骤（1）的扩增产物进行PCR产物的切胶回收及纯化；

（3）用限制性内切酶KpnI和XhoI分别消化步骤（2）的纯化产物和荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic质粒；

（4）将步骤（3）中的消化产物经切胶回收及纯化；

（5）使用T4DNA连接酶将步骤（4）中的纯化产物进行连接；

（6）将步骤（5）中的连接产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞中，挑取的单克隆通过菌液PCR、双酶切鉴定以及测序三重验证；

（7）将步骤（6）中连接正确的质粒转入3T3-L1前脂肪细胞系中，48小时以后使用双荧光报告系统试剂盒测定不同单倍型的转录活性；

（8）将步骤（7）中的不同单倍型转录活性与其与生产性状的关联分析结果进行比对，从转录活性水平解释关联分析结果。

（9）将包含十个突变序列的相应CIDEC片段输入Genomatix数据库（http://www.genomatix.de），搜索识别序列包含或临近这十个突变位点的顺式作用元件。从顺式作用元件与其对应的转录因子水平解释关联分析结果。

如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤（1）所述的引物对P为：

上游引物：cggggtacctgggaacaggagaacatttcag    31bp；

下游引物：ccgctcgagacaagatgccaaggtgacttaca    32bp。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；30个循环94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s；72℃延伸10min。

3.如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤（2）、（4）所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%。

4.如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤（3）所述的酶切体系为：KpnI和XhoI各5μL，10×Buffer M10μL，纯化产物或pGL3-Basic载体质粒<5μg，超纯水补至100μL。

5.如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤（5）所述的连接体系为：10×T4DNALigaseBuffer1μL，DNA片段XμL，pGL3-Basic载体（约50ng/μL）1μL，T₄DNA连接酶（3U/μL）1μL，加超纯水至10μL，其中载体与目的片段的摩尔比控制在1:3-1:8。

6.如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤（6）所述的菌液PCR所使用的引物和扩增条件与步骤（1）中的一样，步骤（6）所述的双酶切体系为：KpnI和XhoI各1μL，10×Buffer M1μL，连接产物质粒<0.5μg，超纯水补至10μL。

7.如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤（7）所述的转染体系为：385ng不同单倍型载体，15ng内参质粒载体pRL-TK，1μL脂质体2000，60μL无血清DMEM培养基。