[发明专利]一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，属于植物生物技术与植物遗传育种领域或者植物试管诱变育种领域。

背景技术

我国是枣树发源地，黄河峡谷流域是枣树的发源地和优生区之一。陕北地区枣树种植资源丰富。木枣为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Zizyphus jujube Mill Muzao)植物，《中国果树志·枣卷》记载其果实中等大，圆柱形，侧面略扁，平均果重14.1 g，果肉厚，绿白色，质地硬，稍粗，汁液较少，昧甜，略具酸味。含可溶性固形物28％~33％，总糖21.7％，酸0.79％，维生素C  461.7mg／l00 g，含水68％，可食率96.8％，适宜制干，品质中上等，制干率48.6％。木枣适应性强，耐旱涝、抗霜冻，山地、平原均可栽种。树势较强，发枝力中等，枝叶密度容易控制。根蘖萌生力弱，生长势强，根系较发达，是理想的退耕还林树种。

植物多倍体诱导后的筛选方法很多，主要有外部形态比较：果树多倍体一般茎变短、叶变厚，叶形指数变小；颜色变深，表面皱缩粗糙、生长缓慢；花、果变大，可育性低。气孔鉴定：多倍体的气孔较二倍体大，叶片单位面积上的气孔数量相对减少。这是一种较为可靠的鉴定方法。花粉粒鉴定：与二倍体相比，多倍体花粉粒体积大，生活力低。梢端组织发生层细胞鉴定：用切片染色法比较组织发生层的三层细胞和细胞核的大小，多倍体的比二倍体的大。染色体记数（直接鉴定法）：用植物的根尖细胞、茎尖细胞或花粉母细胞制片，在显微镜下直接观察染色体数目变化。分子水平鉴定：采用流式细胞仪来测定单个细胞的DNA含量，再根据DNA含量比较来推断出细胞的倍性。宁强（2008）是通过形态学和细胞学经过比较来确定大田条件下枣树苗多倍体的。蒋洪恩（2004）采用Partec DPAC软件对倍性分析仪测定的DNA含量分布曲线分析，并对确定的四倍体做了气孔数量、叶绿体数量、花粉等研究，在他们的研究中发现了大量的嵌合体。王 娜（2005）用组培苗的丛生芽通过秋水仙碱诱变处理获得了变异植株，并结果3~4代的继代培养纯化了嵌合体。严仁玲（1995）经过秋水仙碱处理并对细胞学和气孔做了研究，经过5代的继代培养获得了8个稳定的多倍体系。齐向英（2011）通过染色体变异确定了京枣的同源四倍体，并对其做了气孔分析。

目前报道的均为先进行细胞染色体分析，然后再观察形态学、解破学、孢粉学变化，主要存在以下几个问题：①诱变率多指发生染色体数目变化的数量，后续报道较少；②嵌合体数量较多，纯化培养时间长；③纯化得到的四倍体突变体少。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，旨在解决①诱变率多指发生染色体数目变化的数量，后续报道较少；②嵌合体数量较多，纯化培养时间长；③纯化得到的四倍体突变体少的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，包括以下步骤：

①木枣试管苗诱变的基本程序；②根据形态学特征对诱变后的植株进行第一次筛选；③分化培养对分化出的丛生芽进行第二次筛选；④对筛选的目标丛生芽进行染色体分析；⑤对确定的多倍体进行培养。

进一步，具体包括以下步骤：

⑴ 在木枣试管苗继代培养基中加入秋水仙碱溶液，灭菌冷却后，在超净工作台上将带茎尖枣树试管苗接种在培养基上，每瓶培养基可以接种5~7株试管苗；在光照1 500 lx±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25±1℃条件下培养30d，完成诱变过程；

⑵ 将第一步中的诱变过程完成的枣树试管苗按每瓶一个芽体的方式转接到不含秋水仙碱的新培养基中；

⑶ 将低温培养结束后的枣树试管苗接种在以MS为基本培养基，pH =6.0、附加琼脂55g/L、蔗糖30g/L、6-A1.0mg/L、IBA0.2 mg/L、TDZ0.01 mg/L的培养基上进行连续分化培养；

⑷ 将第三步获得的丛生芽按叶片形态是否变皱褶、茎干是否变粗壮、叶间距是否变短对其进行筛选。筛选后的植株再按单芽体进行培养；

⑸ 对经过再次培养的疑是多倍体进行染色体压片观察，确认其是否是多倍体。

进一步，在木枣试管苗继代培养基中加入30%的秋水仙碱溶液。