[发明专利]一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病原体检测技术领域，尤其涉及的是一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒。 

背景技术

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）属于黄病毒科，是慢性丙型肝炎的病原，迄今为止大约有 2 亿人感染 HCV，感染人口约占全球人口的 2～3%。据报道有些国家HCV 感染率可高达 10%以上例如在非洲和中东一些国家。HCV病毒在遗传变异出表现出来的高变异的特性、以及高效率的细胞培养体系和合适的 HCV 感染小动物模型的缺乏是目前抑制对HCV 深入研究的瓶颈，严重阻碍了科学家对 HCV 生活史、疫苗和特异性抗病毒药物的研究。随着科学技术的发展和不断的深入研究，HCV在病原学、分子生物学、流行病学等领域取得了很多备受关注的研究成果。 

HCV 是一直径约为50nm的球状颗粒。颗粒外表有脂质包膜，结合着宿主来源的脂质或免疫球蛋白。HCV的基因组是一单股正链 RNA 分子。 

不同个体来源或同一个体不同病程阶段的HCV颗粒可表现出显著不同的浮力密度，主要为1.06g/ mL和1.17g/mL两种密度。HCV在被感染宿主体内的主要寄生地是肝脏，其病毒的浓度是外周循环血中的120倍。HCV有严格的宿主限制性，迄今已证实的可感染宿主只有人类和黑猩猩。虽有利用连续传代的细胞系在体外培养条件下支持HCV复制的报道，但是目前尚不能形成可供进行分子生物学研究的体外模型。 

HCV仅有Huh7, Huh7.5, Huh7.5.1三种体外细胞培养系统，黑猩猩﹑恒河猴等灵长类动物可感染HCV，但症状较轻。 

发明内容

提高丙型肝炎病人疗效的最佳途径是早发现、早诊断、早治疗，要实现这一目的最关键的是早期对HCV病原学的确诊，迄今为止广泛应用于临床的丙型肝炎的病原学确诊方法操作繁琐，费时费力，检测试剂和仪器昂贵，检测费用相对较高的缺点。本发明的目的为提供一种特异性高、操作简便、反应迅速、成本低廉的丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒。 

本发明的技术方案如下： 

一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，所述引物序列依次如SEQ ID NO：1 、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4所示。 

所述丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法： 

分别取5μL HCV RNA模板、取引物FIP和BIP各40 pmol/L，引物F3和B3各5 pmol/L，混匀后置于冰上，加入1.6 mol/L betaine，16 mmol/L MgSO₄，40 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 20 mmol/L KCl, 20 mmol/L (NH₄)₂SO₄, 0.2% Tween 20, 2.8 mmol/L dNTPs, Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶50U，补充DEPC处理水至25μL。轻轻混匀反应液，分别置恒温水槽 60℃反应60min，最后80℃孵育 5min以灭活酶终止反应。反应产物于2.5%琼脂糖凝胶l00V电泳 40min，EB染色，全自动凝胶图象分析系统观察。 

结果判定方法：如扩增产物条带呈LAMP特征性梯状条带为阳性，无任何条带为阴性。HCV RNA经RT-LAMP扩增后加入SYBR Green I荧光染料，反应液变绿为阳性，反应液保持橙色为阴性。HCV RNA经RT-LAMP扩增后加入SYBR Green I荧光染料，在紫外灯下观察反应液发出荧光为阳性而阴性对照管未见荧光为阴性。 

丙型肝炎疾病的早期快速确诊是治疗丙型肝炎的基础和首要条件，寻找敏感性高、特异性强、简便及能批量操作的方法具有重要意义。