[发明专利]K14-VEGF转基因小鼠模型及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种K14-VEGF转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，该方法是利用原核显微注射技术将包含人类角蛋白14启动子和鼠编码基因VEGF-A164插入到FVB鼠基因组内，由人类角蛋白14启动子控制的小鼠VEGF-A164表达，使转基因鼠表皮基底层过度表达VEGF-A164。

2.根据权利要求1所述的一种K14-VEGF转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A、PCR扩增如SEQ ID NO:1所示的attB1-mVEGF164-attB2和如SEQ IDNO:2所示所示的attB2r-hGH-attB3，BP反应构建中间载体pDown-mVEGF164和pTail-hGH；

B、利用Gateway克隆技术将pUp-K14、pDown-mVEGF164、pTail-hGH与常规质粒pRP.Des3d进行LR反应，构建pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH，全序列如SEQ ID NO:7所示；

C、阳性克隆测序确认后，线性化后回收相应片段，对受精卵雄原核进行显微注射，制备转基因小鼠并逐步进行繁殖纯化。

3.根据权利要求2所述的一种K14-VEGF转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：

Ⅰ）K14-VEGF164转基因片段的构建

ⅰ）pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH载体的构建

ⅱ）PCR扩增attB1-mVEGF164-attB2和attB2r-hGH-attB3

设计并合成引物如下：

引物名称                引物序列5’to3’

attB1-mVEGF1    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAAG

64              GCGCGCAAGAGAGC（SEQ ID NO:3）；

attB2-mVEGF1    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGTG

64              TGTCTACAGGAATCCC（SEQ ID NO:4）；

attB2r-hGH     GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAGGATCCC

               AAGGCCCAACT（SEQ ID NO:5）；

attB3-hGH      GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGAAATGATG

               CAACTTAATTTTATTAGGAC（SEQ ID NO:6）；

ⅲ)BP反应构建中间载体pDown-mVEGF164和pTail-hGH

ⅳ)LR反应构建pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH

Ⅱ）PCR菌落筛选阳性克隆

菌落PCR筛选pDown-mVEGF164：PCR产物条带理论大小1245bp相符的目的条带；

菌落PCR筛选pTail-hGH图谱：筛选与PCR产物条带理论大小2012bp相符的目的条带；

菌落PCR筛选pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH：筛选与PCR产物条带理论大小1034bp相符的目的条带；

Ⅲ）酶切线性化pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH

MluⅠ/SalⅠ双酶切切出的片段理论大小为5267bp和2823bp，阳性克隆测序确认后，线性化后回收其中的大片段进行转基因小鼠注射；

Ⅳ）通过对FVB鼠受精卵雄原核显微注射步骤Ⅲ）得到的质粒，获得阳性的K14-VEGF转基因小鼠模型。

4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法得到的K14-VEGF转基因小鼠模型。

5.根据权利要求4所述的K14-VEGF转基因小鼠模型，其特征在于，该模型中的小鼠自发地产生如下的银屑病表型特征：真皮微血管增生，表皮渗透性增加，角蛋白细胞异常分化。

6.根据权利要求4所述的K14-VEGF转基因小鼠模型在筛选预防或治疗银屑病药物中的应用。